通用型乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

通用型乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)中釋放出巰基膽堿，使用Ellman試劑后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物，出現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物和人體細(xì)胞、組織、血液、體液等樣品乙酰膽堿酯酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又稱(chēng)為紅細(xì)胞膽堿酯酶（RBC cholinesterase），廣泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在腦組織、神經(jīng)肌肉連接處（neuromuscular junction）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能突觸（cholinergic synapses）和紅細(xì)胞膜上高度表達(dá)，催化主要的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的水解反應(yīng)，產(chǎn)生乙酸和膽堿，終止突觸傳導(dǎo)。其功能在于調(diào)節(jié)乙酰膽堿作用。神經(jīng)毒氣，例如有機(jī)磷沙林（Sarin），抑制乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉癱瘓，最終發(fā)生窒息（asphyxiation）。血清乙酰膽堿酯酶濃度顯著降低與有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑中毒有關(guān)，因此血液檢測(cè)是環(huán)境污染的重要指標(biāo)�；�于人工合成底物碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide）在乙酰膽堿酯酶的作用下，水解產(chǎn)生乙酸和硫代膽堿（thiocholine），與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析乙酰膽堿酯酶的活性。乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

    Acetylcholinesterase 

acetylthiocholine iodide        →      acetate  +  thiocholine

DTNB  +  thiocholine  →   TNB +  choline-S-S-TNB

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）  20毫升

反應(yīng)液（Reagent B）   1毫升

底物液（Reagent C）        2毫升

陰性液（Reagent D）     1毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶自備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里備用
• 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度；底物液（Reagent C）50℃溫育溶解

• 樣品背景對(duì)照測(cè)定

• 移取190微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入25微升陰性液（Reagent D）
• 加入25微升底物液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈） 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品背景對(duì)照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 樣品測(cè)定

• 移取190微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入25微升底物液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、計(jì)算樣品活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 15（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘

五、酶標(biāo)儀測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景對(duì)照和待測(cè)樣品
• 分別移取190微升緩沖液（Reagent A）到96孔板里
• 加入25微升陰性液（Reagent D）到樣品背景對(duì)照孔里
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent B）到待測(cè)樣品孔里
• 分別加入25微升底物液（Reagent C）到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入10微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 15（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 每個(gè)樣品均須背景測(cè)定
• 建議使用比色皿測(cè)定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)15分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為20微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 乙酰膽堿酯酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠生成1微摩爾硫代膽堿所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列乙酰膽堿酯酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感