研究背景       長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）普遍被認為是一類不能編碼蛋白的長鏈RNA。由于其序列較長，所以可以有較大的潛力形成多種復雜構象，從而通過不同生物學途徑發(fā)揮其作用。此外，由于其不具備蛋白編碼能力，因此此類RNA也主要由其堿基序列形成的高級結構來執(zhí)行生物學功能。著名的lncRNA包括CRISPR基因編輯系統(tǒng)中的guide RNA（腳手架功能，scafford）、神經細胞中特異表達的pnky（蛋白互作）以及X染色體沉默相關的Xist（蛋白互作）等。這些lncRNA通過其各自的形態(tài)結構廣泛參與了各種生理生化過程。

       然而，正是由于lncRNA復雜的高級結構以及編碼蛋白的爭論，這使得研究人員對lncRNA的探索困難重重。但是，這也并不是說對lncRNA的研究沒有任何思路和軌跡可循�？茖W研究雖然沒有捷徑，但是找對方向，少走彎路遠比無頭蒼蠅到處飛要高效的多。lncRNA研究雖然在當下頗有難度，但是只要遵循最基本的生命科學研究的遺傳學思維，也可以大大降低lncRNA的研究難度。那么，今天大家就隨小編一同來看一篇2017年6月剛發(fā)表在Nature Cell Biology雜志上的lncRNA反向遺傳學案例。在了解lncRNA在肝癌發(fā)生中的生物學作用的同時，也來學習一下lncRNA的反向遺傳學研究套路。
 

主要研究結論

1. MBNL3癌胚的剪切因子，促進腫瘤發(fā)生導致肝癌預后較差
2. MBNL3敲降可以逆轉肝癌發(fā)生
3. MBNL3誘導lncRNA-PXN-AS1第四個外顯子富集
4. PXN-AS1-L促進PXN基因表達，PXN-AS1-S影響PXN基因穩(wěn)定性
5. MBNL3、PXN與PXN-AS1-L/PXN-AS1-S一同調控肝癌發(fā)生

研究思路
研究結果
 

1. MNBL3表達量與肝癌預后的關聯分析

       由于在之前的工作中，研究人員已經通過表達譜芯片的方法鑒定到了一個在小鼠和人類肝癌組織中高表達的基因mnbl3，因此本工作希望能夠對肝癌發(fā)生的表型從mnbl3的角度進行分子機制的研究。

       通常而言，反向遺傳學研究在通過某一個性狀確定待研究對象（mRNA、lncRNA、circRNA等）之后，便需要對其進行表型觀察。在醫(yī)學領域，表型觀察可以包括對特定細胞系的基因編輯和過表達等以及對臨床樣本進行體內的表型研究等。在此，研究人員采取了傳統(tǒng)的反向遺傳學研究思路，首先對臨床病人的生存率和mbnl3表達量進行了關聯分析。結果發(fā)現，mbnl3的高表達往往伴隨了肝癌病人的高死亡率(圖1a-h）。并且該結果在對人類永生未轉化的肝臟細胞系（QSG-7701），肝癌細胞系（SMMC-7721，HCCLM3，MHCC97H，Huh7和Hep3B）以及肝母細胞瘤細胞系（HepG2）的研究中均得以確認。 2. 轉錄因子OCT4，SOX2以及NANOG可以增加MBNL3的表達

       為了詳細闡明MBNL3在肝癌細胞中的表達機制，研究人員聚焦在了3個干細胞轉錄調控因子OCT4，SOX2以及NANOG上。OCT4，SOX2以及NANOG異常表達可以增加MBNL3的表達量。與MBNL3一致，OCT4，SOX2以及NANOG在肝癌細胞系以及臨床樣本中同樣高表達。生信分析以及ChIP實驗確認了這三個轉錄因子可以結合在MBNL3的啟動子上(圖1k，i）。這些結果表明，肝癌細胞系以及臨床樣本中MBNL3的高表達是由OCT4，SOX2以及NANOG這三個轉錄因子調控的。

3. MBNL3在肝癌細胞與非轉化肝臟細胞中的致癌性

       為了研究MBNL3在肝癌形成中的作用，研究人員對SMMC-7721和QSG-7701進行了MBNL3的穩(wěn)定過表達（圖2）。通過TUNEL等實驗的確認，研究人員認為MBNL3可以驅動肝癌的發(fā)生。該結果在臨床病人樣本中同樣獲得了證實（圖2）。 4. MBNL3對肝癌的發(fā)生必不可少

       為了對MBNL3的表型進行詳細研究，研究人員不僅對MBNL3進行了過表達，還同樣對其在細胞系中進行了敲降實驗，以此來確認MBNL3在肝癌發(fā)生中的重要地位。實驗結果證明，MBNL3敲降的肝癌細胞系癌細胞的生長顯著受到抑制（圖3）。該結果連同MBNL3過表達的表型數據不僅確立了MBNL3在肝癌發(fā)生中的主導地位，同時還為肝癌診斷與治療的臨床應用提供了潛在的治療靶標。

5. MBNL3誘導lncRNA-PXN-AS1第四個外顯子積累

       在之前對MBNL3的反向遺傳學研究中，研究人員已經成功的對MBNL3的表型進行了深入研究，獲得了強有力的證據證實了MBNL3在肝癌發(fā)生中的核心地位。然而一個完整的反向遺傳學研究光有表型數據還是遠遠不夠的，在此研究人員還對MBNL3調控肝癌發(fā)生的具體分子機制進行了深入研究。為達此目的，研究人員首先使用了伯豪生物的全轉錄組測序服務對穩(wěn)定敲除MBNL3的SMMC-7721細胞系以及對照進行了轉錄層面的觀察。對RNA-Seq數據結果除了GO和GSEA富集分析外，研究人員還對找到了527個存在顯著差異的基因可變剪切。在最顯著的可變剪切基因中，研究人員關注到了一個名為lncRNA-PXN-AS1的基因。該基因有5個外顯子，其反義鏈編碼PXN基因。對lncRNA-PXN-AS1基因研究發(fā)現，其含有2個主要的轉錄本分別為PXN-AS1-L（包含第四個外顯子）以及PXN-AS1-S（不包含第四個外顯子）（圖4）。MBNL3的過表達會導致第四個外顯子顯著富集（這暗示了MBNL3可以上調PXN-AS1-L的表達）。紫外交聯的免疫沉淀實驗確認了MBNL3可以識別4號外顯子下游內含子的堿基。 6. PXN-AS1-L以及PXN-AS1-S對PXN具有相反的調控作用

       由于PXN-AS1-L和PXN-AS1-S的反義鏈可以轉錄出和腫瘤相關的PXN基因。因此，研究人員懷疑PXN-AS1-L和PXN-AS1-S可能參與了對PXN的調控。研究人員首先通過實驗與生信分析確認了PXN-AS1-L和PXN-AS1-S都是不具備編碼蛋白能力的lncRNA。其次，對PXN-AS1-L和PXN-AS1-S在SMMC-7721細胞系中的過表達發(fā)現，PXN-AS1-L過表達可以導致PXN表達量上升。然而，令人意想不到的是，PXN-AS1-S過表達卻導致了PXN表達量下降。通過對這兩個lncRNA的深入分析，研究人員發(fā)現PXN-AS1-L是通過結合PXN mRNA的3‘ UTR，保護了PXN mRNA不受miR-24-AGO2復合物降解，從而提高了PXN的表達豐度。與PXN-AS1-L完全不一樣的是，PXN-AS1-S則通過結合PXN mRNA的CDS區(qū)域，抑制了PXN mRNA的翻譯延升，從而抑制PXN蛋白在體內的含量（圖5）。MBNL3則是通過誘導lncRNA-PXN-AS1的4號外顯子表達，間接的增加PXN的表達豐度(圖6）。
6. lncRNA-PXN-AS1的4號外顯子的生物學功能

       為了對lncRNA-PXN-AS1的4號外顯子在肝癌發(fā)生過程中的生物學作用有進一步的了解，研究人員通過對PXN-AS1-L和PXN-AS1-S分別與肝癌發(fā)生進行了表型關聯。結果證明，PXN-AS1-L和PXN-AS1-S在肝癌發(fā)生過程中具有相反的生物學功能(圖7）。

7. MBNL3，lncRNA-PXN-AS1剪切以及PXN在臨床組織中的關聯分析

       如果把一篇完整的邏輯縝密的科研論文比做一篇小說，那么這篇小說不僅僅是內容精彩的小說，還應該是一篇具有完美結局而非虎頭蛇尾的小說。用初中作文的寫作技巧來描述的話，就叫做前后呼應。本研究工作，起始于對MBNL3的功能研究，牽扯到了lncRNA-PXN-AS1以及PXN等，而最終也必將以MBNL3來終結。因此，在本工作最后，研究人員還從整個信號通路的層面闡述了MBNL3和其互作大分子在肝癌發(fā)生中的作用，大大增加了人們對肝癌發(fā)生的認識(圖8）。

討論

       從肝癌研究人員的角度來看，本工作確實是一篇少有的好文章。其意義在于尋找到了一個在肝癌發(fā)生過程中起到主效調控作用的信號通路。為將來肝癌的臨床診斷與治療提供了極大的幫助。從旁觀者的角度來看，本工作又確實是一篇及其典型的lncRNA反向遺傳學研究案例。從性狀到基因定位，再到表型觀察繼而分子機制研究，完美地詮釋了反向遺傳學研究的精髓。為我們對lncRNA研究同仁們提供了絕佳的研究思路。綜合以上兩點，本工作發(fā)表在Nature Cell Biology上是實至名歸的。

原文出處：
Yuan JH, Liu XN, Wang TT, Pan W, Tao QF, Zhou WP, Wang F, Sun SH. The MBNL3 splicing factor promotes hepatocellular carcinoma by increasing PXN expression through the alternative splicing of lncRNA-PXN-AS1. Nat Cell Biol.2017.