腺相關(guān)病毒屬于微小病毒科 (parvovirus)，為無(wú)包膜的單鏈線狀 DNA 病毒，基因組大小約 4.7 kb。利用腺相關(guān)病毒可以將外源基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物組織和細(xì)胞中，具有安全性高、免疫原性低、宿主范圍廣、表達(dá)穩(wěn)定等多種優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)研究。

腺相關(guān)病毒血清型眾多(12種)，不同血清型對(duì)不同組織親和性不同。因此在具體科學(xué)研究中，以下問(wèn)題往往困擾著廣大科研工作者：選擇何種血清型？如何注射？注射多少病毒？注射部位如何選擇？注射多久檢測(cè)？

本文就常見(jiàn)的注射部位（大腦、視網(wǎng)膜、肝臟、心臟和動(dòng)脈、肺臟、腎臟、肌肉、腸）和方法做一個(gè)簡(jiǎn)單的歸納，為大家提供一個(gè)概念和思路。

一、大腦

大腦組織常用血清型有 AAV1，AAV2，AAV5，AAV8 和 AAV9，其中神經(jīng)組織常見(jiàn)的血清型有 AAV2，AAV5 和 AAV8。對(duì)大腦組織而言，AAV5 應(yīng)用范圍更廣，AAV8 更有效（值得注意的是，在猴子的神經(jīng)組織中，AAV5 更有效）。從作用效果上看，AAV8 大于 AAV1。

針對(duì)大腦組織不同部位，AAV 不同血清型靶向性有所差異：

1）海馬組織：AAV9 比 AAV8 更有效；

2）神經(jīng)組織不同的細(xì)胞，不同血清型靶向性不同：如神經(jīng)元常用的血清型有AAV1、AAV2、AAV5 和 AAV9；星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞常用的血清型有 AAV1 和 AAV5 。

總體而言，在所有組織中，AAV2 適用性廣且在腦部組織也有所體現(xiàn)，例如其可以達(dá)到大腦組織 75% 的區(qū)域。AAV2、AAV5、AAV8 和 AAV9 也比較常見(jiàn)，應(yīng)根據(jù)不同組織進(jìn)一步慎重選擇，在此介紹幾種特例：

1、腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric Nervous System ENS)，是由神經(jīng)細(xì)胞組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，遍布整個(gè)腸胃消化管道。其神經(jīng)元的數(shù)量和脊髓相當(dāng)(約1億個(gè)神經(jīng)細(xì)胞)。該神經(jīng)系統(tǒng)在人體軀干下部，屬于迷走神經(jīng)，以薄層的形式分布于消化肌之間，調(diào)節(jié)消化。常用 AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9 ，AAV6 對(duì)腸神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元有一定的靶向性。注射部位可以選擇降結(jié)腸，注射量和滴度： 滴度為 1.3 × 10^12 GC/ml的病毒注射 5 μl 即可。檢測(cè)時(shí)間：注射后 2 周開(kāi)始表達(dá)，2-6 周均有檢測(cè)。

2、腦組織常見(jiàn)的血清型為 AAV9，注射方法：左心室注射或者側(cè)腦室注射。注射劑量和滴度：選擇滴度為 0.5–4.0×10^11 GC/ml 的病毒液，稀釋成 100 μl ，注射兩周之后(14d) 開(kāi)始檢測(cè)。下圖為一些腦部組織注射情況：

Fig1. Transduction and phenotyping of transduced cells in the cerebral cortex

 

Fig 2. Transduction of cells in the hippocampal formation.

Neuroscience 138 (2006) 501–510

 

Fig3. Transduction efficiency of recombinant adeno-associated virus (AAV) in the myenteric plexus (MP) of the enteric nervous system:a comparison across serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9

 

Fig4. Neuronal tropism of recombinant adeno-associated virus (AAV) transduction in the submucosal plexus (SMP): serotypes 1, 2, 5, 6,8, and 9.

Molecular Therapy vol. 23 no. 3 mar. 2015

二、視網(wǎng)膜

視網(wǎng)膜組織常用血清型有 AAV1、 AAV2 和 AAV5 。視網(wǎng)膜組織由于其特殊性，因而有自身的特點(diǎn)：注射成功率 20-30%，容易造成視網(wǎng)膜炎癥和損傷，注射完需要使用 1% 阿托品（和少量新霉素、多粘菌素B硫酸鹽和地塞米松眼膏施用于眼睛，延長(zhǎng)瞳孔擴(kuò)張時(shí)間，減少腺體分泌，減少炎癥反應(yīng)），連續(xù)使用 3-5 d 。其常用的注射量為 0.5 μl ，病毒滴度 1.5x10^7 GC/ml 。常用注射方法：視網(wǎng)膜下注射或者玻璃體注射。

但不同血清型又有不同特點(diǎn)：AAV1 主要作用于視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞，注射后 2-4 周可以檢測(cè)；AAV2 主要作用于感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞和玻璃體，AAV2 玻璃體注射后分布廣泛，2-4 周可以檢測(cè)； AAV5 可作用于視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞，在感光細(xì)胞中表達(dá) AA5>AAV2，2-4 周檢測(cè)。下圖為一些視網(wǎng)膜組織的注射情況：

Fig 5. AAV added to the retinal ganglion cell surface in culture vs. intravitreal injection in vivo.

Vision Research 48 (2008) 377–385

三、肝臟

AAV2、AAV5、AAV7 和 AAV8，其中 AAV7 和 AAV8 的效率是 AAV2 的 10-100 倍。注射部位常選擇門(mén)靜脈、外周靜脈和尾靜脈。注射病毒滴度一般選擇 8×10^10-2×10^12(GC/kg)（人、靈長(zhǎng)類(lèi)）；1×10^11 GC/只鼠，稀釋成 50-100 μl 進(jìn)行尾靜脈注射；注射 2 周之后可以檢測(cè)。下圖為肝臟注射的一些情況：

Fig 6. In vivo vector specificity analysis

四、心臟和動(dòng)脈

對(duì)心臟和動(dòng)脈而言，常用血清型有：AAV1、AAV6、AAV8 和 AAV9 。其中 AAV2、AAV5、AAV7 也可以使用，但是表達(dá)比較慢，3 個(gè)月后表達(dá)量才能與 AAV1、AAV6 表達(dá)量相當(dāng)。所有血清型中 AAV8 和 AAV9 最有效，2 個(gè)月左右其表達(dá)量達(dá)到最高。

常見(jiàn)的注射部位為冠狀動(dòng)脈、主動(dòng)脈、心肌和尾靜脈。注射病毒滴度為 1.9×10^11-10^12 GC/ml，稀釋成 100 μl- 250 μl（大鼠劑量稍高于小鼠）注射；但是對(duì)于心臟原點(diǎn)注射而言，常采用 10^10 GC/ml 病毒滴度，稀釋成 20 μl 使用。檢測(cè)時(shí)間：一般在2周之后可以檢測(cè)。下圖為注射的一些情況：

Biodistribution of LacZ expression and vector genomes 4 weeks after direct injection of 5 ×10¹¹ vg of AAV8- and AAV9-CB-LacZ into the rat heart., heart; Li, liver; Lu, lung; Br, brain; Te, testis; Ki, kidney; Sp, spleen; St, stomach; Ga, gastrocnemius.

HUMAN GENE THERAPY 19:1359–1368

五、肺臟

肺臟常用血清型有 AAV1、AAV2、AAV5、AAV6 和 AAV9。由于肺臟表面唾液酸受體分布比較多，因此 AAV5 型比較常用；相比之下 AAV2 和 AAV6 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相當(dāng)。常見(jiàn)的注射方式有滴鼻、霧化吸入或氣管內(nèi)注射，注射病毒滴度為 10^12 GC/ml ，稀釋成 3 μl，注射完之后 2 周可以檢測(cè)表達(dá)情況。下圖為注射的一些情況：

Histochemical detection of AP expression in mouse lungs 1 month after vector exposure.

JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 2000, p. 1524–1532

六、腎臟

腎臟常用血清型有 AAV2、AAV8  和 AAV9。注射病毒的滴度一般選擇 1-5×10^11 GC/ml，稀釋成 50-200 μl 注射。常見(jiàn)的注射部位有腎動(dòng)脈、腎靜脈和左髂脈、腹主動(dòng)脈，注射完 2 周之后可以檢測(cè)表達(dá)情況。下圖為注射的一些情況：

In vivo long-term transduction by AAV serotype 2 vector into the rat kidney.

Nephron Exp Nephrol 2004;96 :e119–e126

七、肌肉

肌肉組織常用血清型有 AAV2、AAV8 和 AAV9。其中 AAV8、AAV9 最常用，心肌、胰腺和腎上腺也是如此。骨骼肌分為快速和慢速肌纖維，AAV2 常作用于慢速肌纖維，AAV6 則對(duì)二者都有效。對(duì)不同年齡階段的鼠，注射劑量有所不同：幼鼠選擇的病毒量為 7×10^10-1.2×10^11 GC/g；成年鼠選擇的病毒量為 3.5 ×10^11-7×10^12 GC/只；但是低劑量的 AAV9 不能到達(dá)所有心肌細(xì)胞。下圖為注射的一些情況：

Transduction of muscle fibersby different AAV serotypes.

J Gene Med 2005; 7: 442–451.

Representative photomicrographs of sections of skeletal muscle

MOLECULAR THERAPY Vol. 14, No. 1, July 2006

八、腸

腸組織常用血清型有 AAV1、AAV2  和 AAV5。常見(jiàn)的注射方式有口服、灌腸、腹腔注射、腸系膜動(dòng)脈注射。一般選擇注射滴度 1×10^11 GC/ml ,稀釋成 100 μl（PBS或者稀釋液稀釋?zhuān)┦褂�，注�?2 周后可以檢測(cè)。

 

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