摘要

目的：研究不同強(qiáng)度重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, , rTMS )對(duì)腦梗死大鼠條件性恐懼記憶的影響。

方法：雄性成年SD大鼠40只，體重200 -250 g ，采用改良Zea longa線栓法對(duì)大鼠制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞的腦梗死模型。建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組及40% (0.76 T),60% (1.14 T),80% (1.52 T)強(qiáng)度刺激組，每組8只，另外假手術(shù)組8只。各刺激組大鼠于建模成功后第5d開始按照設(shè)定參數(shù)分別接受磁刺激，連續(xù)5 d,假手術(shù)組和模型組置于相同磁場(chǎng)環(huán)境，但不接受磁刺激。治療結(jié)束后，給予各組大鼠相同足底電擊(55 V,2 s)，在24 h后檢測(cè)大鼠在5 min內(nèi)的僵直持續(xù)時(shí)間。結(jié)果各刺激組大鼠在接受足底電擊24 h后的僵直持續(xù)時(shí)間均明顯高于模型組(P < 0.01)，并且隨著刺激強(qiáng)度的增加，大鼠在24 h后的僵直持續(xù)時(shí)間也明顯增長(P < 0.01)。結(jié)論:rTMS能促進(jìn)腦梗死大鼠記憶功能的恢復(fù)，并隨著刺激強(qiáng)度的加強(qiáng)，大鼠記憶能力的恢復(fù)程度亦增強(qiáng)。

腦梗死(cerebral infarction)是指因腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧所導(dǎo)致的局限性缺血性壞死或軟化。作為一種高發(fā)病率和高致殘率的疾病，腦梗死給人類健康和生命帶來威脅的同時(shí)也影響患者日常生活能力，給社會(huì)及家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激技術(shù)(repetitive transcranial magnetic stimula-tion, , rTM S是一種利用脈沖磁場(chǎng)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(主要是大腦)，改變皮層神經(jīng)細(xì)胞的膜電位，使之產(chǎn)生感應(yīng)電流，影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動(dòng)，從而引起一系列生理生化反應(yīng)的磁刺激技術(shù)，作為一種新的精神神經(jīng)系統(tǒng)治療技術(shù)，具有無痛、無創(chuàng)、安全和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于治療帕金森病、癲癰、抑郁癥、腦梗死、脊髓損傷等疾病的臨床治療中，并取得了較好的療效。條件性恐懼的形成是一種學(xué)習(xí)和記憶的過程，本研究旨在通過對(duì)腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的觀察來研究 rTM S對(duì)腦梗死后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)作用，同時(shí)探索其治療強(qiáng)度與功能恢復(fù)程度的關(guān)系，為rTMS將來更好地應(yīng)用于臨床腦梗死患者的治療提供指導(dǎo)依據(jù)。

材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年SD雄性大鼠，體重約200一250(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，鼠齡12周，在飼養(yǎng)籠里給予12 h光/暗周期，可自由采食水和食物，隨機(jī)取8只作為假手術(shù)組，其余大鼠制成右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞腦梗死模型，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組及40% (0.76 T) ,60% (1.14 T) ,80%(1.52 T)強(qiáng)度刺激組，每組8只。

1.2儀器

武漢依瑞德公司生產(chǎn)的磁場(chǎng)刺激儀(CCY-1型);上海欣軟superfcs條件性恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

1.3腦梗死動(dòng)物模型的制作

參照改良Zea longa線栓法制成右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型。動(dòng)物蘇醒后表現(xiàn)為提尾時(shí)左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲;同側(cè)Homer氏征;爬行時(shí)向左劃圈;站立時(shí)左側(cè)傾倒。凡具有上述體征者列入研究對(duì)象。共用大鼠100只，有32只符合入選條件并存活到規(guī)定時(shí)間。假手術(shù)組僅作右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎，術(shù)后無病理行為學(xué)改變。

1.4治療方法

刺激組在造模成功后第2d行rTM S治療，將大鼠頭部固定，使其在刺激過程中保持清醒、安靜和舒適。磁場(chǎng)線圈中心處于大鼠肉門右旁開0.5 cm處。設(shè)計(jì)刺激參數(shù)為:刺激頻率1 Hz，刺激強(qiáng)度為40%(0.76 T),60%(1.14 T),80%(1.52 T)輸出強(qiáng)度;3組/d,5序列/組，20次/序列，每個(gè)序列間隔l0s，每組間隔60 s，連續(xù)刺激5d，每天于14:00一15:00實(shí)施刺激，假手術(shù)組和模型組置于相同磁場(chǎng)環(huán)境，但不接受磁刺激。

1.5記憶能力評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練和檢測(cè)兩個(gè)部分，各組大鼠均于治療結(jié)束后第2d行場(chǎng)景性條件性恐懼實(shí)驗(yàn)。每次使用電擊箱前用95%乙醇擦拭箱底和鋼絲，將大鼠分別置于無聲，無特殊氣味的測(cè)試箱中，適應(yīng)3 min后，開始給予短暫足底電擊(SSV,2s)共6次，2次足底點(diǎn)擊時(shí)間間隔平均為90 s ( 60一120 s隨機(jī)變化)，最后1次電擊結(jié)束后30 s將大鼠放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練結(jié)束24 h后進(jìn)行記憶形成和保持能力的測(cè)試，將大鼠放入同一電擊箱中無電刺激呈現(xiàn)，觀察并用秒表記錄大鼠5 min內(nèi)僵直(Freezing)反應(yīng)時(shí)間。僵直的判定標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)物接受刺激信號(hào)后，除呼吸運(yùn)動(dòng)外，全身其他軀體運(yùn)動(dòng)全部停比的狀態(tài)。在這一行為模型中，僵直反應(yīng)時(shí)間的長短反映大鼠對(duì)電擊這一場(chǎng)景的恐懼記憶程度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每組樣本數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P < 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠恐懼記憶能力明顯下降，rTMS組大鼠恐懼記憶能力均明顯高于模型組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)，在刺激組中，隨著刺激強(qiáng)度的增加，大鼠在24 h的僵直時(shí)間也明顯增長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。見表1。

3討論

重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(rTM S )是1991年在經(jīng)顱磁刺激基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的神經(jīng)電生理技術(shù)，無痛無創(chuàng)、操作方便、安全可靠，能影響局部和遠(yuǎn)隔皮層功能，實(shí)現(xiàn)皮層功能區(qū)域性重建，影響多種神經(jīng)遞質(zhì)和基因表達(dá)水平，目前在抑郁癥、帕金森病、癲癰、神經(jīng)J哇疼痛、脊髓損傷和腦卒中等疾病臨床治療中得到廣泛的應(yīng)用。臨床研究表明，rTMS能促進(jìn)腦梗死患者肢體功能的恢復(fù)和提高患者的日常生活能力[n}。目前研究中腦梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶行為評(píng)估實(shí)驗(yàn)多以Y型迷宮和水迷宮為主[A-9]，條件性恐懼的形成也是一種學(xué)習(xí)和記憶的過程，本研究以條件性恐懼記憶作為學(xué)習(xí)記憶評(píng)估實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示rTMS能促進(jìn)腦梗死大鼠記憶功能的恢復(fù)，并隨著刺激強(qiáng)度的加強(qiáng)，腦梗死大鼠記憶能力的恢復(fù)程度亦增強(qiáng)。

目前，有關(guān)rTMS能促進(jìn)腦梗死大鼠記憶能力恢復(fù)可能的機(jī)制研究較多。已有研究報(bào)道, rTMS能促進(jìn)腦梗死大鼠海馬突觸素(Syn)的表達(dá)，Syn是突觸囊泡的一種特異標(biāo)志性膜蛋白，其數(shù)量和分布密度可間接反映突觸的密度，突觸作為神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，其密度增多，海馬區(qū)神經(jīng)元之間的傳遞和聯(lián)系隨之增強(qiáng);此外，磁刺激也可增加腦梗死側(cè)皮層腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元再生，刺激軸突的芽生和新突觸的形成，抑制促凋亡蛋白Bax , BAD等，從而對(duì)腦梗死部位產(chǎn)生多種神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)mo;另有研究報(bào)道 , rTMS治療也能抑制缺血組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和增加神經(jīng)可塑性，可用于腦梗死后亞急性期記憶功能恢復(fù)的治療;另外，rTMS能調(diào)節(jié)miR-25/p57信號(hào)通路，能促進(jìn)腦梗死后腦室下區(qū)成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，加強(qiáng)腦梗死后的自我修復(fù)能力。

rTMS對(duì)腦梗死患者療效作用與許多因素有關(guān)，主要因素則是刺激參數(shù)的設(shè)置如強(qiáng)度、頻率、刺激持續(xù)時(shí)間等，本實(shí)驗(yàn)在保證除強(qiáng)度外的其它參數(shù)相同的前提下發(fā)現(xiàn)隨著刺激強(qiáng)度的加強(qiáng)，大鼠記憶能力的恢復(fù)程度亦增強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，這可能與磁刺激能影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移有關(guān)，且隨著刺激強(qiáng)度的增強(qiáng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移能力也增強(qiáng)。在保證治療安全的前提下，本研究?jī)H探討不同強(qiáng)度重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的影響，對(duì)其余參數(shù)如頻率、刺激總量等對(duì)腦梗死治療的量效關(guān)系有待進(jìn)一步基礎(chǔ)和臨床研究。