胚胎基因編輯解析：借助電轉(zhuǎn)方法將Cas9蛋白質(zhì)/sgRNA導(dǎo)入小鼠原核受精卵生成非嵌合體突變體

基因編輯技術(shù)指能夠讓人類(lèi)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，就有著其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

應(yīng)用方向

1. 基因敲除：如果想使某個(gè)基因的功能喪失，可以在這個(gè)基因上產(chǎn)生DSB，非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)的過(guò)程中往往會(huì)產(chǎn)生DNA的插入或刪除（indel），造成移碼突變，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。
2. 特異突變引入：如果想把某個(gè)特異的突變引入到基因組上，需要通過(guò)同源重組來(lái)實(shí)現(xiàn)，這時(shí)候要提供一個(gè)含有特異突變同源模版。正常情況下同源重組效率非常低，而在這個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生DSB會(huì)極大的提高重組效率，從而實(shí)現(xiàn)特異突變的引入。
3. 定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因：與特異突變引入的原理一樣，在同源模版中間加入一個(gè)轉(zhuǎn)基因，這個(gè)轉(zhuǎn)基因在DSB修復(fù)過(guò)程中會(huì)被拷貝到基因組中，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因。通過(guò)定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因的方法可以把基因插入到人的基因組AAVS1位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)是一個(gè)開(kāi)放位點(diǎn)，支持轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)，破壞這個(gè)位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞沒(méi)有不良影響，因此被廣泛利用。

下面這篇文章就是針對(duì)第三個(gè)應(yīng)用方向的成功闡述。 

借助電轉(zhuǎn)方法將Cas9蛋白質(zhì)/sgRNA導(dǎo)入小鼠原核受精卵生成非嵌合體突變體

摘要

CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于各種有機(jī)體，特別是小鼠，用來(lái)闡明基因的作用。為了獲得優(yōu)化的小鼠胚胎，Cas9 mRNA和sgRNA通常通過(guò)注射或是電轉(zhuǎn)導(dǎo)入受精卵。然而，由此種方法生成的大多數(shù)突變體都是嵌合體，包含不同類(lèi)型的突變體，導(dǎo)致復(fù)雜的表型分析。為了使基因功能分析更加簡(jiǎn)化，急迫的需要尋找一種生成非嵌合體突變體的方法。這里，我們確定了一種方法，可以生成非嵌合體小鼠突變體胚胎。我們通過(guò)電轉(zhuǎn)化同時(shí)導(dǎo)入Cas9蛋白質(zhì)和sgRNA 入離體小鼠受精卵。確�；�因編輯發(fā)生在小鼠基因組的第一次復(fù)制之前。結(jié)果，所有細(xì)胞都攜帶相似的突變體表現(xiàn)型。這個(gè)方法解決了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的嵌合體突變體的問(wèn)題。

材料與方法

電轉(zhuǎn)化

CUY21 EDIT II和LF501PT1-10 鉑金盤(pán)電極（長(zhǎng)：10mm，寬：3mm，高：0.5mm，gap：1mm）(BEX Co. Ltd., Tokyo, Japan)用于電轉(zhuǎn)化。

電極連接在電轉(zhuǎn)化儀上，另一端連接在體式顯微鏡下。30-40個(gè)來(lái)自于交配受孕或體外受孕的受精卵同時(shí)進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。受精卵培養(yǎng)在KSOM培養(yǎng)基內(nèi)，用Opti-MEM I 清洗三遍，去掉血清，在電極的槽內(nèi)縱向排列成一條直線，并添加5uL Opti-MEM I，并加入Cas9蛋白質(zhì)和sgRNA或mcherry mRNA。電轉(zhuǎn)條件是30V （3ms 脈沖時(shí)長(zhǎng)+97ms間隔）7個(gè)cycle。電轉(zhuǎn)后，受精卵立即從電擊槽中取出，分別用M2培養(yǎng)基洗4次、KSOM培養(yǎng)基洗2次。隨后受精卵培養(yǎng)在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，直至出現(xiàn)二細(xì)胞階段。

結(jié)果

圖 通過(guò)電轉(zhuǎn)化Cas9蛋白質(zhì)和sgRNA生成Fgf10突變體胚胎。（a）Fgf10基因和sgRNA靶序列。（b）電轉(zhuǎn)化發(fā)生的時(shí)間。電轉(zhuǎn)發(fā)生在體外受孕后5h。交配受孕受精卵電轉(zhuǎn)發(fā)生在E0.5。（c）代表胚胎展示了不同的肢體表現(xiàn)型：T1（沒(méi)四肢）T2（肢體缺陷，無(wú)前肢或無(wú)后肢）。Control受到電擊，但是沒(méi)有轉(zhuǎn)入Cas9蛋白和RNA。

總結(jié)

我們闡述了這種方法，將Cas9蛋白質(zhì)和sgRNA轉(zhuǎn)入體外受精的卵細(xì)胞中，生成突變體。在DNA第一次復(fù)制前，通過(guò)NHEJ-介導(dǎo)的缺失插入或是HDR-介導(dǎo)的基因插入，生成嵌合度較低的突變小鼠。我們的電轉(zhuǎn)方法對(duì)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模式小鼠非常有效。

文章出處

Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 2016