研究結(jié)果

dek2影響籽粒正常發(fā)育

研究人員從玉米種質(zhì)中心獲取dek2的突變體并且對(duì)其與W22雜交，使其背景純化，以利于表型觀察。在對(duì)其表觀以及細(xì)胞層面上的觀察發(fā)現(xiàn)，dek2的突變體籽粒和野生型相比，顯著變小，百粒重只有野生型32%，總蛋白含量下降4%，醇溶蛋白下降21%，非醇溶蛋白含量上升38%，淀粉粒體積顯著減小，并且籽粒胚乳糊粉層發(fā)育受到顯著抑制（圖1，2）。

dek2的圖位克隆

為了對(duì)dek2進(jìn)行基因定位，研究人員使用了圖位克隆的方法。經(jīng)過(guò)對(duì)438粒突變體籽粒的初定位以及3358粒籽粒的精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)，GRMZM2G110851的單堿基SNP導(dǎo)致了該表型的產(chǎn)生（圖3）。

dek2編碼了一個(gè)P-type PPR蛋白

GRMZM2G110851在基因組上含有1893個(gè)堿基長(zhǎng)度并且編碼了一個(gè)630個(gè)氨基酸的蛋白（圖3）。BLASTP的比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因編碼了一個(gè)P-type PPR蛋白，包含了10個(gè)PPR重復(fù)序列（圖3）。在第914位堿基G-A的突變導(dǎo)致了Gly-Glu的變化，從而產(chǎn)生了突變體表型。該結(jié)果同時(shí)被UniformMu轉(zhuǎn)座子突變的等位測(cè)試確認(rèn)（圖3）。

dek2是一個(gè)保守的線粒體定位蛋白

PPR蛋白在植物中廣泛存在。研究人員為了確認(rèn)dek2的進(jìn)化地位，構(gòu)建了dek2全長(zhǎng)蛋白序列的進(jìn)化樹。結(jié)果表明，dek2同源基因廣泛存在于被子植物中，而在玉米中沒有同源基因（圖4）。對(duì)dek2的共聚焦顯微鏡亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，dek2與線粒體marker存在共定位，即dek2定位于線粒體內(nèi)嵴。

dek2影響nad1內(nèi)含子1的剪切

由于PPR蛋白可以與對(duì)應(yīng)的線粒體或者葉綠體RNA互作，因此研究人員對(duì)18DAP dek2突變體胚乳以及野生型胚乳的線粒體轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了分析。研究人員使用特異的引物擴(kuò)增了線粒體cDNA，在35個(gè)基因中，只有nad1的成熟轉(zhuǎn)錄本在dek2中顯著下降（圖5）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，nad1內(nèi)含子1在dek2中顯著下降導(dǎo)致了全長(zhǎng)成熟轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量下降。

dek2影響了線粒體復(fù)合物I的聚集

為了深入研究線粒體的呼吸復(fù)合物，研究人員奮力了dek2 18DAP線粒體蛋白并且進(jìn)行了非變性的BN-PAGE電泳。電泳結(jié)果顯示，復(fù)合物I含量顯著下降（圖6）。該結(jié)果證明了nad1內(nèi)含子1的剪切影響導(dǎo)致了復(fù)合物I功能的下降。

dek2影響了線粒體的正常功能

研究人員為了對(duì)dek2在籽粒發(fā)育過(guò)程中的作用有全局性的了解，分別選取了18DAP的dek2胚乳以及野生型胚乳進(jìn)行了RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq服務(wù)由上海伯豪提供）。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析，一共篩選到了2065個(gè)差異基因，其中1095個(gè)基因具有功能注釋。在GO歸類后，研究人員發(fā)現(xiàn)，這些基因主要聚集于GO: 004429 455 (Mitochondrial part, p-value=8.43E-13); GO: 0003942 (GTPase activity, 456 p-value=3.08E-08); GO: 0006119 (Oxidative phosphorylation, 457 p-value=0.000853); and GO: 0006626 (Protein targeting to mitochondrion, 458 p-value= 0.00488) 。其中，包含了一個(gè)維持TCA循環(huán)穩(wěn)定的Aox2基因。該基因在dek2中表達(dá)量上升1162倍。

原文出處：Qi W,Yang Y,Feng X,Zhang M,Song R.Mitochondrial Function and Maize Kernel Development Requires Dek2, a Pentatricopeptide Repeat Protein Involved in nad1 mRNA Splicing.Genetics. 2017

作者簡(jiǎn)介