聶愛英

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

Q-Exactive；BioPharma Finder；單抗；二硫鍵解析

 

目前，在全球范圍內(nèi)，單克隆抗體藥物已經(jīng)成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域中最耀眼的一顆明珠。該類抗體藥物具有靶向性專一、特異性高和毒副作用低等特點，代表了藥物治療領(lǐng)域的最新發(fā)展方向，并且在抗腫瘤和自身免疫系統(tǒng)缺陷治療領(lǐng)域得到了強有力的推廣。我國的抗體藥物產(chǎn)業(yè)也在如火如荼的進(jìn)行中，在抗體藥物的前期研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控過程中，抗體藥物的完整分子質(zhì)量、輕重鏈分子質(zhì)量、肽圖、糖鏈、二硫鍵等結(jié)構(gòu)特征信息需要進(jìn)行嚴(yán)格、快速的監(jiān)測和質(zhì)控，從而保證抗體藥物的有效性和安全性。

 

其中，二硫鍵作為共價鍵交聯(lián)多肽鏈內(nèi)或鏈間的兩個半胱氨酸，對于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、維持正確的空間折疊構(gòu)象、保持及調(diào)節(jié)其生物活性等都起著舉足輕重的作用，尤其對于生物藥品，二硫鍵的位置和連接情況對于生物藥物的空間結(jié)構(gòu)、藥物活性等起著關(guān)鍵的作用。X 射線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析法、多維核磁共振法、二硫鍵異構(gòu)及突變分析法、酶解法和化學(xué)裂解法等方法都可以用于二硫鍵定位分析，但這些方法普遍存在檢測速度慢、樣品要求純度高、人工操作復(fù)雜等局限性，不過，隨著質(zhì)譜儀器在質(zhì)量檢測范圍、分辨率、靈敏度、準(zhǔn)確度和分析速度等方面的不斷提高，使得質(zhì)譜分析法已經(jīng)可以簡單、快速的應(yīng)用于二硫鍵的定位分析中，不僅可以實現(xiàn)已知二硫鍵的確認(rèn)，而且還可以實現(xiàn)未知二硫鍵的發(fā)現(xiàn)和鑒定，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其它檢測方法。

 

目前，基于先進(jìn)的四級桿技術(shù)和超高場 Orbitrap 質(zhì)量分析器的 Q-Exactive HF 儀器平臺，可以為生物制藥分析提供更加快速、靈敏、準(zhǔn)確的二硫鍵、分子量、肽圖、糖鏈等重要信 息。同時，由國際領(lǐng)先生物制藥公司 Amgen 和 Thermo Fisher 共同開發(fā)的，為生物制藥公司量身定做的 BioPharma Finder 生物制藥軟件，可以為生物制藥客戶提供抗體藥物相關(guān)的二硫鍵、分子量、肽圖、糖鏈、氨基酸突變位點以及各種后修飾位點等的定性和定量信息。在這里我們主要介紹基于 Q-Exactive HF 儀器平臺和 BioPharma Finder 生物制藥軟件的簡單、快速的抗體藥物二硫鍵解析。

 

 

質(zhì)譜儀器：Q-Exactive HF（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Easy Nano1000 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：自制反相 Nano 色譜柱（C18，2 μm，75×150 μm ，100 Å）；

試劑：色譜級甲酸、二次去離子水，色譜級乙腈，鹽酸胍（Sigma-Aldrich，美國），碳酸氫銨（Sigma-Aldrich，美國），Trypsin（Promega，美國）。

 

IgG1類型的單抗藥物置于 6 M 鹽酸胍體系中，室溫變性 1 小時，使用超濾管進(jìn)行溶液體系置換，終溶液為 50 mM 碳酸氫銨，然后加入 Trypsin、酶和蛋白的質(zhì)量比為 1:40，37 度過夜酶切，加入 1% 甲酸終止酶切，旋轉(zhuǎn)凍干，備用。（變性時間和酶解時間可以根據(jù)樣品的不一致性進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整）

 

色譜分析條件：具體見表 1；

質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；

 

表 1. 二硫鍵分析的色譜條件

 

表 2. 二硫鍵分析的質(zhì)譜條件

 

使用 BioPharma Finder 1.0軟件對原始譜圖進(jìn)行二硫鍵分析，數(shù)據(jù)庫為抗體藥物對應(yīng)的氨基酸序列，搜庫參數(shù)基本使用軟件的默認(rèn)設(shè)置，勾選二硫鍵搜索，無需指定二硫鍵可能的鏈接位置，如圖 1 所示。

 

圖 1. BioPharma Finder 1.0 軟件中二硫鍵設(shè)置模塊

 

現(xiàn)在商業(yè)化最多的單克隆抗體為 IgG1 類型的單抗藥物，該類型的抗體中，主要存在 16 對二硫鍵，其中重鏈內(nèi)部有 8 對，輕鏈內(nèi)部有 4 對，輕鏈和重鏈鏈間有 2 對，重鏈鏈間有 2 對，考慮到單抗結(jié)構(gòu)的對稱性，最終，非冗余的二硫鍵共 9 對。以正在測試的單抗藥物為例，理論二硫鍵的連接情況如圖 1 所示。

 

 

圖 1. IgG1 類型單抗藥物的二硫鍵連接形式以及正在測試的單抗藥物的理論二硫鍵的具體連接信息。

 

得益于 Q-Exactive HF 的超高靈敏度、超高質(zhì)量精度和超快采集速度，該測試抗體藥物的 9 對二硫鍵連接形式僅在 Trypsin 酶解的肽段產(chǎn)物中就都得到了 100% 的鑒定覆蓋，充分體現(xiàn)出 Q-Exactive HF 的強大定性能力。

 

首先以重鏈中 HC22-HC96 的二硫鍵連接為例，如圖 2 所示，肽段 AEDTAVYYCAK 和 LSCAASGFTFDDYAMHWVR 的二級碎片信息非常豐富，同時一級母離子的質(zhì)量偏差在 1.58 ppm，因此可以準(zhǔn)確、快速的確定二硫鍵的連接情況。

 

圖 2. 肽段 AEDTAVYYCAK 和 LSCAASGFTFDDYAMHWVR（HC22-HC96）的二硫鍵連接二級碎片譜圖

 

其次，以輕鏈中 LC23-LC88 的二硫鍵連接為例，如圖 3 所示，肽段 VTITCR 和 FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQR 的二級碎片信息也非常豐富，同時一級母離子的質(zhì)量偏差在 1.73 ppm，因此可以準(zhǔn)確、快速的確定二硫鍵的連接情況。

 

 

圖 3. 肽段 VTITCR 和 FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQR（LC23-LC88）的二硫鍵連接二級碎片譜圖

 

最后，以重鏈鉸鏈區(qū)的兩對相近的二硫鍵 HC230-HC230和 HC233-HC233 為例，如圖 4 所示，肽段 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 和 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 的二級碎片信息也非常豐富，同時一級母離子的質(zhì)量偏差在 1.70 ppm，因此可以準(zhǔn)確、快速的確定這兩對二硫鍵的連接情況。

 

 

圖 4. 肽段 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 和 THTCPPCPAPELL

GGPSVFLFPPKPK（HC230-HC230 和 HC233-HC233）的二硫鍵連接二級碎片譜圖

 

本文基于 Q-Exactive 儀器平臺和 BioPharma Finder 數(shù)據(jù)分析軟件，實現(xiàn)了單抗藥物簡單、快速的二硫鍵解析，為單抗藥物的初期研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控提供了高效、可靠的分析測試方法。除此之外，Q-Exactive 系列的質(zhì)譜儀器，憑借其超高的分辨率、超快的掃描速度和超高的質(zhì)量精度，必將助力于生物制藥行業(yè)的深度質(zhì)譜分析。