摘要

近期，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛地應(yīng)用于突變體小鼠的構(gòu)建，但是借助于微注射方法很大程度上限制了基因編輯于高通量上的應(yīng)用。這篇文章中，我們闡述了一個(gè)簡(jiǎn)單，高效，大規(guī)模的基因編輯方法：即借助于電轉(zhuǎn)染將RNAs轉(zhuǎn)入卵，而不是通過顯微注射。我們用這種方法將單鏈寡脫氧核苷酸（ssODN）轉(zhuǎn)入小鼠卵，構(gòu)建敲除突變體。研究結(jié)果證明此方法使得大規(guī)�；�因分析成為現(xiàn)實(shí)。

材料和方法

小鼠、卵和胚胎

使用ICR和B6D2F1(C57BL/6XDBA2F1)孕鼠。ICR主要用于電轉(zhuǎn)條件摸索，而B6D2F1用于基因編輯。

從E0.5的輸精管中收集受精卵。ICR和B6D2F1和同種雄鼠自然雜交。基因編輯試驗(yàn)中，從B6D2F 1和R26-H2b-mCherry雄性雜交得到的卵，培養(yǎng)在mWM培養(yǎng)基中等待電轉(zhuǎn)染。

電轉(zhuǎn)染

應(yīng)用BEX定制電極（長(zhǎng)：10mm，寬：3mm，高：0.5mm，間距：1mm）圖1.

電極連接在CUY21EDIT II主機(jī)上面（BEX，Tokyo，Japan），并將電極置于體視顯微鏡下。培養(yǎng)在mWM中的卵用Opti-MEM I 清洗三次。加入5ul的RNA進(jìn)行混合，放置于電極狹縫中�？梢噪娹D(zhuǎn)40-50個(gè)胚胎。電轉(zhuǎn)條件設(shè)定為30V，7times。電轉(zhuǎn)之后，立即將卵轉(zhuǎn)出在mWM培養(yǎng)基中，37℃,5%CO2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后15h觀察mCherry熒光。

結(jié)果與分析

分別借助mCherry mRNA和無肢基因Fgf10進(jìn)行轉(zhuǎn)染，得到電轉(zhuǎn)受精卵存活并發(fā)育成兩細(xì)胞階段的比率是94-95%，比微注射方法（34-35%）要高很多。

當(dāng)我們使用400ng/ul的Cas9 mRNA和200ng/ul gRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，87%的胚胎表現(xiàn)出缺失前、后腿，圖2c（type I）所示；對(duì)I型突變體進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)Fgf10基因等位基因全部被打斷。

隨后，我們檢測(cè)了不同濃度的Cas9 mRNA和gRNA對(duì)于基因編輯的效率。200ng/ul Cas9 mRNA和50ng/u的gRNA，73%的胚胎無肢；100ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，32%展示肢體殘缺（圖2bc)；50ng/ul Cas9 mRNA 和25ng/ul的gRNA，胚胎大多正常。

為了進(jìn)一步確定基因組編輯的效率，將mCherry mRNA轉(zhuǎn)入11只小鼠中，發(fā)現(xiàn)所有11個(gè)小鼠都沒有紅色熒光（圖3b）。這一結(jié)果說明電轉(zhuǎn)染的方法還可以用于高效產(chǎn)生HDR介導(dǎo)的基因敲除小鼠。

接下來，我們探討了這種突變是否會(huì)在下一代中遺傳下來。電轉(zhuǎn)200ng/ul Cas9 mRNA和100ng/ul的gRNA入卵細(xì)胞，靶向mCherry基因。 觀察25只F0代小鼠，均無紅色熒光表達(dá)。而且所有的F1代小鼠同樣沒有紅色熒光，說明mCherry基因被打斷。以上揭示了應(yīng)用該電轉(zhuǎn)染方法得到的基因編輯突變體是可以穩(wěn)定遺傳。

圖2借助電轉(zhuǎn)染方法實(shí)現(xiàn)的CRISPR/Cas9基因編輯         圖3電轉(zhuǎn)染mCherry RNA形成的缺失突變體

討論

綜上所述，借助電轉(zhuǎn)染方法我們確立了一種高效高存活率的CRISPR/Cas9基因編輯方法。 因?yàn)殡娹D(zhuǎn)染的方法不需要微注射技術(shù)就可以同時(shí)處理40-50個(gè)胚胎，使得構(gòu)建小鼠突變體更簡(jiǎn)單快速。便于大規(guī)模的快速分析F0表型等研究。