Q Exactive中TMT定量工作流程的參數(shù)優(yōu)化和Proteome Discoverer2.1數(shù)據(jù)處理方法
Q Exactive 系列儀器中 TMT 定量工作流程的儀器參數(shù)優(yōu)化和 Proteome Discoverer 2.1 軟件數(shù)據(jù)處理方法
Xiaoyue Jiang1, Tabiwang Arrey2, Eugen Damoc2, Michaela Scigelova2, David Horn1, Rosa Viner1, and Andreas F.R. Huhmer1
1Thermo Fisher Scienti c, San Jose, CA, USA; 2Thermo Fisher Scienti c, Bremen, Germany
關鍵詞
Q Exactive Plus，Q Exactive HF，TMT，Proteome Discoverer 2.1，蛋白質鑒定，相對定量，同量異序標簽，多重定量
研究目標
在 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 儀器平臺上，采用 Thermo ScientificTM TMTsixplexTM 和 TMT10plexTM 工作流程，建立最優(yōu)的質譜數(shù)據(jù)采集方法將其應用于蛋白質的相對定量研究中。本文詳細介紹了該工作流程所涉及的樣品前處理、肽段分離和質譜分析等過程，以及采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 軟件 2.1 版本對數(shù)據(jù)進行處理和分析的具體流程。
背景介紹
同量異序標簽（如 Tandem Mass 標簽TM （TMTTM）1 或 isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification（iTRAQ®）2）是基于質譜技術的蛋白質相對定量方法中非常常見的一種。3-6 其中，基于 TMT 標簽的多重相對定量方法具有很多優(yōu)勢，包括整個實驗周期更短、波動更小，樣品通量更高，以及樣品間定量數(shù)據(jù)的缺失更少等。標記氨基的 TMT10plex 與 TMTsixplex 反應試劑的化學結構相同但是前者在質量報告區(qū)域中可以提供更多的 13C 和 15N 同位素組合形式。對于某些組合間彼此僅相差一個中子的質量，需要高分辨率的分析儀器實現(xiàn)串聯(lián)質譜譜圖采集才能進行區(qū)分。
Thermo ScientificTM TribridTM 質譜儀家族，包括 OrbitrapTM FusionTM MS 和 Orbitrap Fusion LumosTM MS 儀器，所提供的同步母離子選擇（SPS）MS3 方法能夠在具有高動態(tài)范圍的復雜樣品中實現(xiàn)最為準確的 TMT 定量分析。7，8 而 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 質譜儀系列儀器，結合了四極桿對母離子選擇的高選擇性和高特異性與 Orbitrap 質量分析器的高分辨率和準確質量（HRAM）檢測能力的優(yōu)勢，也是進行同量異序定量分析的一把好手。Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus 質譜儀通過配備改進的四極桿技術（AQT）以優(yōu)化離子選擇能力和傳輸效果，同時提高了在窄小的隔離窗口內對低豐度離子進行定量分析的能力。9 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM HF 質譜儀引入了超高場 Orbitrap 質量分析器，能夠以兩倍于 Q Exactive Plus MS 的掃描速度實現(xiàn)高分辨率檢測，表現(xiàn)出了更為優(yōu)異的性能。9
基于 Q Exactive 質譜儀的 TMT 標記定量分析流程，不僅能夠實現(xiàn)肽段和蛋白質鑒定結果的最大化，而且能夠同時為多達十個不同樣品提供高定量準確度的相對定量結果。該流程的前提是需要良好的色譜分離效果、充分分辨的質譜峰、足夠的離子豐度，以及能以高掃描速度采集高質量的 MS2 碎裂譜圖。本應用文檔為 TMT 標記及其相對定量策略提供了詳細的分步指導，包含樣品前處理、儀器設置，以及采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 2.1 軟件對多重定量數(shù)據(jù)進行處理和分析。本文詳細討論了關鍵儀器參數(shù)（分辨能力、最大注入時間、自動增益目標值、碰撞能量和隔離窗口等）對蛋白質和肽段鑒定以及定量結果的影響，以保證用戶能夠參照本文成功地在 Q Exactive 系列質譜儀上建立 TMT 定量工作流程。
實驗方法
TMT 標記
采用 Thermo Scientific TMT 試劑對 E. coli 酶解產(chǎn)物標準樣品（Waters® Corp，Milford，MA）按如下步驟進行標記：
1. 將三乙胺碳酸鹽 （TEAB） 緩沖液、TMT 標簽和干粉狀態(tài)下的樣品從 -20 ℃ 轉移至室溫下平衡。
2. 將 500 μL 溶解緩沖液 （Dissolution Buffer，1 M TEAB） 加入到 4.5 mL 超純水中，制備 100 mM TEAB 溶液。
3. 將單個樣品（不超過 100 μg/TMT 標簽） 溶于 100 mM TEAB 緩沖液，得到 1 μg/uL 的樣品溶液，充分渦旋振蕩，放置 10 分鐘。
4. 在每個 TMT 試劑瓶中加入 41 μL 新鮮 LC-MS 級乙腈，充分渦旋振蕩，放置 10 分鐘。
5. 在每個 TMT 試劑瓶中加入不高于 100 μL 第 3 步中制備的樣品溶液，渦旋振蕩，孵育 1 小時。
6. 反應 1 小時后，向每個小瓶中加入 8 μL 5% 羥胺（將試劑盒中提供的 50% 羥胺儲備液用水稀釋 10 倍）以終止反應，孵育 15 分鐘。
7.標記結束后，立即按所需比例混合不同樣品。在本研究中，TMTsixplex 試劑（通道 126-131）的混合比例為 20:10:1:1:10:20。所選六種 TMT10plex 試劑（通道 127C，128N，128C，129N，129C，130N）以相同比例混合。
8. 將制備好的樣品分成小份，干燥，在 -80 ℃ 下儲存。
9. 進行 LC-MS 分析前將制備好的 TMT-標記樣品重懸于 0.1% TFA/5% ACN （v:v）溶劑中；重懸好的 TMT-標記樣品能夠在 4 ℃ 穩(wěn)定保存一周，避免反復凍融。
為考察定量分析的準確度，將 Thermo ScientificTM PierceTM HeLa 蛋白酶解產(chǎn)物標準樣品（P/N 88328）按上述流程進行標記，將 TMTsixplex 通道 129–131 和 TMT10plex 通道 127N、127C 和 128N 分別以 10:10:10 比例混合，然后加入 E. coli 樣品中，每通道比例為 1:1（33 μg HeLa 酶解產(chǎn)物 + 67 μg E. coli 酶解產(chǎn)物）。
液相色譜
色譜分離條件設置詳見表 1。進樣量相當于 1 μg 起始蛋白質。
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參數(shù) |
設置 |
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LC |
Thermo ScientificTM EASY-nLCTM 1000 |
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流動相 |
A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1 % 甲酸乙腈溶液（Fisher Chemical） |
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洗脫梯度 |
0-100 min 7–25% B；100-120 min 25–60% B；121 min 95% B，保持 95% 5 min |
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流速 |
300 nL/min |
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捕集柱 |
Thermo ScientificTM AcclaimTM PepMapTM 100 C18 LC 柱，75 μm x 2 cm，Thermo ScientificTM DionexTM nanoViperTM，C18，3 μm，100 Å（P/N 164705） |
|
分離柱 |
Thermo ScientificTM EASY-SprayTM C18 LC 柱，75 μm x 50 cm，2 μm，100 Å（P/N ES803） |
質譜儀
通過液相色譜洗脫得到的肽段分別由 Q Exactive Plus 和 Q Exactive HF 質譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下進行分析。儀器參數(shù)設置參見表 2。
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Q Exactive Plus |
Q Exactive HF |
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全掃 MS 參數(shù) | ||
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分辨能力 （m/z 200 處的 FWHM） |
70,000 |
120,000 |
|
自動增益目標值（AGC） |
3e6 |
3e6 |
|
最大注入時間 （ms） |
50 |
50 |
|
掃描范圍 （m/z） |
375-1400 |
375-1400 |
|
MS2 參數(shù) | ||
|
分辨能力 （m/z 200 處的 FWHM） |
35,000 |
30,000 （TMTsixplex）
60,000 （TMT10plex） |
|
自動增益目標值（AGC） |
1e5 |
1e5 |
|
最大注入時間 （ms） |
100 |
100 |
|
隔離窗口（Th） |
0.7 或 1.2 |
0.7 或 1.2 |
|
歸一碰撞能量 （NCE） |
32 |
32 |
|
環(huán)數(shù)（Loop count） |
10 或 15 |
10 或 15 |
|
起始質荷比（First fixed mass） |
100 |
100 |
|
最小填充比（Underfill ratio） |
2% |
2% |
|
電荷數(shù)識別（Charge state recognition） |
2-7 |
2-7 |
|
肽段匹配（Peptide match） |
優(yōu)選 |
優(yōu)選 |
|
動態(tài)排除（Dynamic exclusion（s）） |
30 |
30 |
采用 Proteome Discoverer 軟件 2.1 版本（PD 2.1）進行數(shù)據(jù)處理。該軟件的特色是提供了全新改進版的 TMT 定量分析工作流程，其新功能包括：1）可用于添加報告離子同位素分布的全新用戶界面；2）解析 TMT10plex 試劑中報告離子同位素雜質的能力；3）實現(xiàn)基于信噪比（S/N 值）的 TMT 定量分析；4）根據(jù) S/N 值歸總進行蛋白質和肽段定量分析； 5）提供對肽段和蛋白質豐度值進行歸一化和標準化新方法。
在開始新研究之前，通常需要先更新定量分析方法，其編輯流程為：
1. 進入 Administration，選擇 Maintain Quantification Methods。其中提供了常用定量分析方法的模板。
3.同位素分布值應按照該研究所用 TMT 試劑分析證書（CoA）中提供的信息進行添加。相關信息可在 http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/90110?ICID=search-product 上通過試劑瓶上的批次號查詢獲得。
4. 根據(jù)研究需要，在“active”列中選擇/去除報告離子通道。
5. 保存新創(chuàng)建的定量分析方法。新創(chuàng)建的研究專用定量分析方法參見圖 1。
2. 導入 FASTA 數(shù)據(jù)庫
2. 用 Add 功能導入本地硬盤上已有的 .FASTA 文件。
3. 另一種方法是使用 Download 功能，鍵入 taxonomy ID，從蛋白質中心下載數(shù)據(jù)庫文件。
1. 在 Proteome Discoverer 軟件起始頁面選擇 New Study and Analysis（圖 2）。
2. 定義 Study Name 并指定 Study Directory，將文件保存在特定的文件夾中。
3. 若要進行 Processing Workflow，通過倒三角圖標選擇可用模板，選擇“ProcessingWF_QE active\PWF_QE_Reporter_Based_Quan_Seque tHT_Percolator.pdProcessingWF”。
4. 若要進行 Consensus Workflow，選擇“ConsensusWF CWF_Comprehensive_Enhanced_Annotation_Quan pdConsensusWF”。
5. 選定第一部分中創(chuàng)建的 Quantification Method，然后選定 Control channel Selection。
7. 選擇 OK，數(shù)據(jù)文件會在新窗口打開。
8. 對于涉及平行分析的復雜研究，推薦使用 Study Factors 管理功能進行結果分組、歸一化以及展示。若要添加 Study Factors，在當前研究頁面選擇 Study Definition tab，選擇 Add 來添加類別或數(shù)字類型的因素。鍵入因素名稱和所有相關因素（圖 3）。如無需使用 Study Factor，直接進入第四部分的工作流程設置操作。
9. 在 Input Files tab 條目下應該能夠顯示導入的原始文件。可以用左側三角形圖標展開查看文件細節(jié)。根據(jù)實驗設置為每個文件和報告離子指明 Sample Type 和 Study Factors。
10. 完成后查閱 Sample tab——此時所有研究因素應當已經(jīng)自動更新。
首先在 workflows tab 下打開 Processing Workflow。模板里已經(jīng)包含了質量數(shù)容許偏差、報告離子定量分析說明和常見修飾，只需要再細化以下幾個參數(shù)。
1. 在 Processing Workflow 的 SequestHT 節(jié)點下，選擇 Protein Database�？赏瑫r選擇多個蛋白質數(shù)據(jù)庫。
2. 在 Processing Workflow 的 SequestHT 節(jié)點下，指定 TMT 為肽段氮端和賴氨酸殘基上的 static modification。（請注意：TMTsixplex 和 TMT10plex 都對應 229.163 Da 質量增加）。
4. 打開 consensus Workflow ，選擇 Protein Marker 節(jié)點。選定需要在結果中標示的蛋白質。因為樣品是 E. coli 和人源蛋白的混合物，定義兩類標志物便于后續(xù)分析（E. coli 和人類的） （圖 5）。
5.進入 Peptide and Protein Quantifier 節(jié)點。將 Apply Quan Value Corrections 設置為 True，Co-Isolation Threshold 設為 50， Average Reporter S/N Threshold 至少設為 10（圖 6）。Scaling Mode 選用 On Channel Average （Per File），這樣對于每個平行分析結果來說，其中每個通道的豐度值都會進行按比例縮放。更多關于參數(shù)如何設置的細節(jié)參見參考文獻 11。
7. 進入 Grouping & Quantification 條目并指明研究中的變量。該設置會決定定量分析結果分組和顯示的方式。本例中選擇了 Quan Channel 和 isolation windows，因此平行分析的結果會按不同隔離窗口分組并取平均，使其能夠非常方便地在最終報告中進行比較。具體操作方式是選定這兩個變量，并通過選擇每個變量左側的上下箭頭把 isolation windows 移到 Quan Channel 上方。請注意變量的順序會影響 Bulk Ratio Generation 中的分組方式。選定對照組 130N Quan Channel 作為這兩個提取窗口的 Denominator， 再選 Add Ratios。Generated Ratios 參見圖 7。更多關于如何設置研究變量的細節(jié)請參見參考文獻 11。
8. 點擊 Analysis 右上角的 Run，開始運行 Job Queue 中的 Processing 和 Consensus Workflow 搜索。
1. 搜索結束后，選亮 Consensus search，選 Open Results�；蛘哌M入 Analysis Results 條目，選亮分析行再選擇 Open Results。
2. 蛋白質和肽段的分組數(shù)量顯示在屏幕下方。
3. 對每個蛋白質/肽段組，根據(jù)蛋白質標志物節(jié)點中設置的物種歸屬結果也被顯示出來（圖 8）。
4. 進入工具欄 View 條目，選擇 Display Filter。從全部文件中過濾所有被鑒定為源于 E. coli 的蛋白質組和肽段組（圖 9）。
5. 要得到兩個研究因素中每個因素下的鑒定結果總數(shù)，使用如圖 10 所示的條件進行濾篩。
6. 要得到可定量的肽段數(shù)量，進入 View，選擇 Distribution Charts。在 Bar Charts 中選擇 Peptide Groups-Quan Info 可以顯示有和沒有 Quan Values 的肽段組（圖 11）。
仔細設置每個質譜分析參數(shù)對基于 TMT-標記實驗實現(xiàn)絕對靈敏和準確的定量分析至關重要。一般來說，更長的梯度能夠提供更好的色譜分離效果、更小的離子抑制效應以及更少的共洗脫物干擾情況。高度分辨的 MS1 和 MS2 譜圖對于準確的肽段和蛋白質相對定量結果的獲取不可或缺。MS2 最大注入時間、AGC、NCE 以及 MS2 隔離窗口等儀器參數(shù)的設置都會影響 MS/MS 譜圖的質量和定量結果。因此在保證儀器高采集速率的同時，應當慎重地選擇這些參數(shù)。
肽段的化學修飾會影響其疏水性，從而改變其色譜保留行為。TMT-標記樣品的洗脫通常需要更高比例的有機相。表 3 和 4 分別提供了對未標記和標記的細胞裂解液樣品進行色譜分離的推薦梯度，總梯度時間為 2 小時。
|
時間 |
時長 |
流速 |
%B |
|
0 |
N/A |
300 |
2 |
|
5 |
5 |
300 |
2 |
|
105 |
100 |
300 |
20 |
|
125 |
20 |
300 |
32 |
|
126 |
1 |
300 |
95 |
|
134 |
8 |
300 |
95 |
|
時間 |
時長 |
流速 |
%B |
|
0 |
N/A |
300 |
5 |
|
3 |
3 |
300 |
5 |
|
5 |
2 |
300 |
7 |
|
105 |
100 |
300 |
25 |
|
125 |
20 |
300 |
60 |
|
126 |
1 |
300 |
95 |
|
134 |
8 |
300 |
95 |
MS2 最大注入時間需要根據(jù)進樣量、樣品復雜程度和洗脫梯度進行調整。通常來說，更長的注入時間能夠積累更多的母離子，報告離子的強度會相應增加，更有利于中低豐度肽段的鑒定和定量分析。如圖 16 所示，最大注入時間從 64 ms 增加到 100 ms 大大提高了可定量蛋白質和肽段的數(shù)量，也相應地實現(xiàn)了更高的定量分析率。
如前所述，更長的洗脫梯度需要更長的注入時間。另一方面，注入時間的增加不應該顯著影響儀器的整體速度，尤其是在分析復雜樣品的時候。一個理想的方法是將可允許的最大注入時間設成與 FT 轉換檢測時間匹配，因為該時間是與儀器分辨率設置直接相關的。對于 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 來說，128 ms 的 Orbitrap 分析器檢測時間對應的分辨率分別是 35,000 和 60,000，因此使用 100 ms 的注入時間與檢測時間非常匹配，能夠保證離子注入與 Orbitrap 檢測的高效并行。如圖 17 所示，增加注入時間同樣有利于提升定量檢測的準確度。
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MS2 IT |
MS2 AGC |
MS2 NCE |
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Method 1 |
64 ms |
5e4 |
30 |
|
Method 2 |
100 ms |
5e4 |
30 |
|
Method 3 |
100 ms |
1e5 |
30 |
|
Method 4 |
100 ms |
1e5 |
32 |
自動增益目標值是需要設置的另一個關鍵參數(shù)，其大小決定了 C trap 能積累并進入 Orbitrap 分析器中進行檢測的最大離子數(shù)。雖然 S/N 和鑒定效率會隨著離子數(shù)增加而增加，但偏高的 AGC 目標值設置會造成離子聚集或其他與空間電荷相關的問題。13 圖 16 和 17 中比較了當進樣量為 1 μg 時，AGC 目標值設置成 5e4 和 1e5 的定量結果差異。當該參數(shù)設置為 1e5 時，能夠在獲得更多可定量肽段的基礎上，達到更好的定量準度和精度，而并未引起離子聚集現(xiàn)象。
MS2 碰撞能量
Q Exactive 類型的儀器通常建議使用 2 Th 的隔離窗口，能夠保證足夠的離子傳輸和靈敏度。然而，擴大隔離窗口會使干擾離子與母離子一并被隔離出來，降低了報告離子的定量分析準確性。
此外，干擾離子的碎片還有可能污染 MS2 譜圖并導致鑒定得分降低。Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 都配備了 AQT，使得其在非常窄的隔離窗口設置下也能實現(xiàn)有效離子傳輸。我們分別在 0.7 和 1.2 Th 的隔離窗口設置下對 E. coli 樣品進行分析，其鑒定和定量結果非常接近（圖 18）。
1）采用更長的洗脫梯度、更長的柱子和更高上樣量。
2）為不同 TMT 標簽調整 MS2 分辨率設置。
3）讓最大注入時間與分辨能力相匹配以實現(xiàn)最優(yōu)的質譜工作循環(huán)。
4）根據(jù)標簽數(shù)提高 AGC MS2 目標，TMT10plex 最高可以設為 1e5。
5）在不會過度碎裂肽段的前提下提高 NCE 。
6）四極桿相對于傳統(tǒng)方法更窄的母離子隔離窗口，更適合鳥槍法（shortgun）測序的應用。
TMT 標記能夠提高樣品分析通量并支持高達十個不同的生物樣品的相對定量，包括細胞、組織和體液。本研究用 TMTsixplex 和 TMT10plex 標記的 E. coli 細胞裂解液樣品評估了 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 儀器在蛋白質/肽段鑒定效率和定量分析精度方面的性能。
Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 非常適合分析中低復雜度的樣品。而對于高復雜度樣品來說，最好能采用預分級的方式以提高定量分析精度和準確度。通過比較并優(yōu)化多組不同參數(shù)設置，包括 MS2 分辨能力、最大注入時間、自動增益目標值和隔離窗口等，實現(xiàn)了最高的鑒定效率和最準確的定量分析。同時，本文還詳細介紹了樣品前處理和液相色譜等相關設置，以及如何采用 Proteome Discoverer 軟件 2.1 版本進行數(shù)據(jù)處理的方法和流程。
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2. Ross, P. et al. Mol Cell Proteomics 2004, 3(12), 1154.
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14. Arrey, T. et al. Thermo Scientific Poster Note 64412.
400 650 5118（支持手機用戶）
