水產(chǎn)品中恩諾沙星藥物殘留檢測儀的操作流程

恩諾沙星(Enrofloxacin)是一種化學(xué)合成的廣譜抗菌藥物，是氟喹諾酮類藥物的代表產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖、臨床等各個領(lǐng)域。

該類藥物的耐藥性、殘留毒性以及不良反應(yīng)等的報(bào)道越來越多。

世界許多國家都針對該類藥物制定了動物性食品中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

恩諾沙星的檢測一般采用色譜法作為確證性檢測方法；近年來快速篩選檢測的免疫分析方法引起越來越多的關(guān)注。

本研究旨在建立水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留的一步式ELISA快速檢測方法，以進(jìn)一步提高快速篩選檢測效率。

通過對傳統(tǒng)兩步式間接競爭ELISA競爭反應(yīng)模式、反應(yīng)時間、洗滌時間等主要因素的優(yōu)化改進(jìn)，建立了恩諾沙星一步式間接競爭ELISA檢測體系；利用不同的偶聯(lián)方法，建立并優(yōu)化了恩諾沙星酶標(biāo)抗體的合成方法，并以所制備的酶標(biāo)抗體為基礎(chǔ)建立了標(biāo)記抗體型一步式直接競爭ELISA檢測模式，并進(jìn)行了加標(biāo)水產(chǎn)樣品的檢測驗(yàn)證。

需要的器材和試劑
4.1 儀器：CSY-E96S水產(chǎn)品藥物殘留檢測儀、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：無水乙腈、正己烷、濃HCl

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：
配液1：0.15M鹽酸溶液
    取5ml濃鹽酸，加入去離子水中定容到400ml。
配液2：樣本提取液
    量取10ml 0.15M鹽酸溶液（配液1）加入到90ml無水乙腈中混合均勻。
配液3：復(fù)溶液
    將5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 動物組織（雞肉、豬肉、魚、蝦）處理方法
1）稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；
2）加入8ml樣本提取液（配液2），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
3）取2ml清澈上層有機(jī)相至潔凈干燥的10ml玻璃試管中，50-60℃水浴氮?dú)獯蹈桑?BR>4）加入1ml正己烷，振蕩2分鐘，再加1ml復(fù)溶液（配液3），振蕩30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
5）去除上層正己烷，取下層水相50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.3ppb

5.3.2 蜂蜜處理方法
1）取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中，加6ml樣本提取液（配液2），振蕩5分鐘，使其充分溶解；
2）加入3ml復(fù)溶液（配液3），加入11ml二氯甲烷，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；
3）吸去上層，取下層有機(jī)相8ml至干燥溶器中，50-60℃水浴氮?dú)獯蹈桑?BR>4）用1ml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物，再加入正己烷1ml混合30秒，室溫3000轉(zhuǎn)/分以上，離心5分鐘；
5）去除上層取下層50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.4ppb

5.3.3 牛奶處理方法：
1）取25µl樣本液與475µl復(fù)溶液（配液3）混合，振蕩1分鐘，使其充分溶解；
2）取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：3ppb

5.3.4 奶粉處理方法：
1）稱取0.5±0.02g均質(zhì)物至10ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml去離子水，振蕩，使其充分溶解；
2）取100µl樣本液與400µl復(fù)溶液（配液3）混合，振蕩1分鐘；
3）取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：50    檢測下限：6ppb

5.3.5 雞蛋處理方法：
1）稱取1.0±0.02g均質(zhì)物至10ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml去離子水，振蕩，使其充分溶解；
2）取100µl樣本液與400µl復(fù)溶液（配液3）混合，振蕩1分鐘；
3）取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：30    檢測下限：3ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝    A    ×100%
    A0    
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

http://www.csy17.com/news1431.html