束縛應(yīng)激所致小鼠腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)和行為改變及運動干預(yù)效果

摘要：為了探討束縛應(yīng)激對小鼠神經(jīng)遞質(zhì)、行為的影響及有氧運動的干預(yù)效果。選用 1 月齡 C57BL/6 小鼠 80 只，隨機分為 4 組：控制組(Control，n=20 只)、束縛應(yīng)激組(Stress，n=20 只)、運動組(Ex，n=20 只)、運動束縛應(yīng)激組(Stress+Ex，n=20 只)�？刂平M安靜飼養(yǎng)，束縛應(yīng)激組進(jìn)行2 周的束縛應(yīng)激，運動組每天進(jìn)行 2 h 跑臺鍛煉，運動束縛應(yīng)激組同時進(jìn)行束縛應(yīng)激和跑臺鍛煉。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：行為試驗中，束縛應(yīng)激組小鼠社交行為顯著下降、焦慮及抑郁行為水平發(fā)生顯著上升(P<0.05)，而運動干預(yù)能夠緩解束縛應(yīng)激對這些行為的影響。生化指標(biāo)同樣說明有氧鍛煉有效緩解了束縛應(yīng)激導(dǎo)致的行為和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的改變。結(jié)果說明：束縛應(yīng)激會導(dǎo)致社交及情緒相關(guān)行為的改變，而運動干預(yù)會起到有效的緩解作用。

關(guān)鍵詞：運動生理學(xué)；束縛應(yīng)激；運動；社交行為；單受神經(jīng)遞質(zhì)；小鼠

持續(xù)壓力會造成人或者動物改變社交習(xí)慣、降低認(rèn)知能力，甚至產(chǎn)生抑郁或者焦慮等情緒失調(diào)。因此，探索壓力應(yīng)激對個體腦及行為塑造作用機制對保障人類身心健康具有重要意義。束縛應(yīng)激是廣泛使用的模擬人類生活壓力應(yīng)激的動物模型之一。束縛應(yīng)激會影響動物的多種行為學(xué)和生物學(xué)指標(biāo)，其中包括對學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知方面的損害、社交互動行為的改變。急性束縛應(yīng)激會使機體產(chǎn)生負(fù)性情緒，造成腦部的海馬神經(jīng)元損傷，樹突棘和增生物增加。慢性束縛應(yīng)激因改變 HPA 軸的敏感性而造成行為的改變。大量研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著大腦皮層、海馬及外周血中兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)及代謝物含量的改變，慢性束縛應(yīng)激會顯著降低實驗動物的認(rèn)知功能。束縛應(yīng)激會造成神經(jīng)內(nèi)分泌改變，包括兒茶酚胺的降低及皮質(zhì)酮應(yīng)激反應(yīng)敏感性下降。這種神經(jīng)內(nèi)分泌的改變與神經(jīng)元中五羥色胺受體功能和表達(dá)的上升及五羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)分泌的改變相關(guān)。慢性應(yīng)激會使杏仁核中的神經(jīng)元極度活躍，造成相對應(yīng)神經(jīng)元的損傷。而動物研究表明，運動可調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，如五羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)及它們的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而會起到積極的干預(yù)作用。

雖然束縛應(yīng)激對神經(jīng)遞質(zhì)及行為影響的研究多見報道，但是運動對慢性束縛應(yīng)激干預(yù)效應(yīng)和機制研究相對較少。因此，本研究用小鼠慢性束縛應(yīng)激模型考察運動干預(yù)效果，探索其作用機制。

1  實驗材料和方法

1.1  試劑與儀器

1)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)購自美國 Sigma 公司，純度≥ 98.0％；乙腈：色譜純，采用美國 Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；高氯酸、碳酸氫鉀、冰醋酸等均為分析純，南京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；實驗用水為自制二次重蒸水。

2)LC.10AD vp 高效液相色譜儀、SPD-10AD vp 熒光檢測器、色譜柱為島津 Shim-pack  VP-ODS 的 CTs液相色譜柱(150  ibm×4.6  mm×5  μm)(日本島津公司)；GL.88B 旋渦混合器(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)；電恒溫水浴裝置(江蘇光都機電設(shè)備有限公司)；Supermaze動物行為分析系統(tǒng)、社交行為箱、高架十字迷宮、新物體識別箱、強迫游泳實驗箱(上海欣軟公司)。

1.2  實驗動物和實驗設(shè)計

C57BL/6 小鼠(3 周齡)購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。小鼠養(yǎng)在通風(fēng)的隔籠里，室溫為 20~25 ℃，相對濕度 60%  ，光暗周期為 12  h，保持安靜，食物和水按時提供。在正式實驗前所有小鼠均預(yù)先適應(yīng) 1 周并且每天都進(jìn)行小鼠稱重。80 只小鼠隨機分成4 組，每組 20 只，控制組(n=20 只)，束縛應(yīng)激組(n=20只)，運動組(n=20 只)，運動束縛應(yīng)激組(n=20 只)。具體實施方案如下：適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，束縛應(yīng)激為每天上午 10：00 開始持續(xù) 120 min，跑臺鍛煉時間為下午18:00 持續(xù) 30 min，每周訓(xùn)練 5 d，共 2 周。束縛應(yīng)激方法：取 50 m L 圓柱形離心管(管底留一個 3 mm 半徑小孔)，將小鼠放在只能容納小鼠整個軀體的管子中，將管子放在同一房間的不同籠子中，放置時間是上午09：00—11：00。跑臺鍛煉方法：進(jìn)行平坡的跑臺運動，速度 0.8 km/h，坡度為 0°，實驗開始前 1 天下午18：00 對小鼠進(jìn)行一次 15 min 的適應(yīng)性訓(xùn)練，然后第2 天按上述運動方案訓(xùn)練。其中運動束縛應(yīng)激組同時進(jìn)行束縛應(yīng)激和運動干預(yù)；束縛應(yīng)激組只束縛應(yīng)激；運動組只運動干預(yù)；控制組與其它組小鼠一起飼養(yǎng)，無運動干預(yù)和束縛應(yīng)激。所有動物實驗均遵循東南大學(xué)倫理委員會指導(dǎo)文件操作。

1.3  指標(biāo)檢測

1 月齡小鼠正處于青少年期，為了研究是否束縛應(yīng)激會導(dǎo)致焦慮、抑郁以及社交行為的改變。在兩周實驗完成后，依次進(jìn)行社交行為實驗，高架十字迷宮、新奇-抑制攝食試驗以及強迫游泳實驗來驗證小鼠的焦慮和抑郁水平及運動干預(yù)對小鼠這些行為的影響，行為實驗結(jié)束后，平衡 24 h 后處死并迅速檢測不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平。

1)社交行為實驗。

社交行為實驗采用包含有3個相同大小的房間(40 cm×40 cm×20 cm)的社交行為觀察室，中間為空房間并有通向兩側(cè)房間的通道，兩側(cè)房間分別各放 1 個鼠籠。實驗小鼠分兩類，一類為社交行為專用陌生小鼠(stranger)，而另一類為實驗鼠。測試選用 2 只社交行為專用陌生小鼠 1 和 2，均為雄性，年齡、體重相近，同實驗小鼠品系相同且實驗前沒有接觸過的小鼠。 用不透明的樹脂玻璃板隔離左右側(cè)兩個房間。實驗開始前將實驗鼠放入行為觀察箱的中間房間適應(yīng) 5 min，期間將陌生小鼠隨機放入一側(cè)房間的鼠籠中。實驗小鼠可以同陌生小鼠隔著鼠籠相互嗅探，但無法進(jìn)行肢體接觸。正式實驗開始時移去隔離板，通過動物行為分析系統(tǒng)分別記錄10 min內(nèi)實驗小鼠同空鼠籠或陌生小鼠的互動時間和房間逗留時間。互動時間=實驗小鼠直接接觸鼠籠+距 2 cm 內(nèi)直立嗅探的時間。實驗小鼠在每個房間的逗留時間以每只小鼠頭和四肢均進(jìn)入房間后為準(zhǔn)。實驗結(jié)束后將實驗小鼠取出、歸籠。每次實驗后用體積分?jǐn)?shù)為 70%酒精清潔整個測試裝置以備下一個實驗。具體過程見圖 1。

如圖 1 所示，籠中的為陌生小鼠，籠外的為實驗小鼠，社交行為實驗前后包括兩個階段：第 1 階段同時記錄(A)實驗小鼠在陌生小鼠 1 或空鼠籠所在房間的逗留時間和(B)實驗小鼠同空鼠籠或陌生小鼠 1 互動的時間；第 2 階段為(C)實驗小鼠在陌生小鼠 1 或陌生小鼠 2 所在房間的逗留時間和(D)實驗小鼠同陌生小鼠 1及陌生小鼠 2互動時間。

2)高架十字迷宮實驗。

將小鼠放在十字迷宮正中間，高度距離地面 1 m，兩邊為封閉臂，另兩邊為開放臂。用電子路徑系統(tǒng)記錄小鼠停留在開放臂和封閉臂的時間以及路徑。迷宮需用體積分?jǐn)?shù)為 70%的乙醇和水清洗、干燥無味后進(jìn)行下一只動物實驗。

3)新奇-抑制攝食試驗。

小鼠剝奪飲食一段時間后，分別放在新物體識別箱(60cm×60cm×30 cm)里。將1粒球狀鼠糧置于實驗箱底的中心，每只小鼠放于實驗箱底的角落，自由活動12min。記錄每只小鼠第1次吃到食物的時間，分別記錄測試結(jié)束后 30 min 內(nèi)每只小鼠在籠中的飲食情況。

4)強迫游泳實驗。

將小鼠放在水桶的中心(水溫 24~25  ℃；水桶半徑 20 cm，高 40 cm) 10 min。小鼠無法接觸水桶的底部。小鼠的行為通過視頻路徑監(jiān)控系統(tǒng)自動記錄。儀器自動記錄小鼠的潛在不動的時間及最后 4  min 的掙扎時間(四肢強烈掙扎、劃擦水桶壁)。

5)小鼠取材。

每只小鼠稱重后隨機分組，每周一下午 18：00鍛煉前，用電子天平(JZC-XXC，上海亞津科技有限公司)稱量各組小鼠體重。行為測試結(jié)束后靜置 24 h，斷頸椎處死，迅速剝離不同腦區(qū)并取血，腦組織樣品稱重，加入 50  μL 用冰預(yù)冷的 0.1  mol/L 高氯酸(含 10-7mol/L 維生素 C)用微量勻漿機勻漿，勻漿液再 5 200×g 離心(4℃) 30 min，然后用 0.22  μm 濾膜過濾并將 10 μL 濾液用 990  μL 蒸餾水稀釋到 1 m L，吸取 20  μL稀釋液注射到色譜儀進(jìn)行分析，其他樣品迅速置于-80℃保存。

6)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物檢測。

小鼠腦部的單胺神經(jīng)遞質(zhì)及其衍生物采用高效液相色譜熒光檢測法：采用 ESA MD-150 色譜柱(150 mm×3.2 mm，2.0 µm)，C18 預(yù)柱(10 mm×3 mm，3 µm)。激發(fā)波長為 345 nm，發(fā)射波長為 480 nm；流動相選擇：用 0.45  μm 的微孔濾膜過濾，超聲脫氣乙腈和 15 mmol/L 醋酸鹽緩沖液(p H4.7；35︰65，體積比)流速：1.0 m L/min，柱溫：30  ℃，進(jìn)樣量：20  μL。

7)數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

所有數(shù)據(jù)均錄入 SPSS18.1 統(tǒng)計軟件，并通過方差分析統(tǒng)計束縛應(yīng)激以及運動干預(yù)的作用。

3  討論

束縛應(yīng)激是模擬人類生活壓力改變?nèi)祟惿缃弧⑶榫w及認(rèn)知等多種行為最常見的動物模型。同時，束縛應(yīng)激也是廣泛應(yīng)用的應(yīng)激障礙疾病動物模型，不但可以模擬免疫下降、認(rèn)知功能下降，還可以使小鼠產(chǎn)生焦慮及抑郁等癥狀。越來越多的證據(jù)說明，束縛應(yīng)激對腦具有塑造作用，這種塑造作用可以表現(xiàn)為基因、神經(jīng)內(nèi)分泌及行為學(xué)的改變。應(yīng)激將單胺類遞質(zhì)系統(tǒng)激活后，會對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此重復(fù)應(yīng)激會使機體對應(yīng)激產(chǎn)生適應(yīng)。

在應(yīng)激狀態(tài)下，實驗動物的腦內(nèi)可出現(xiàn) 5-HT 更新速率增加，使 HPA 軸過度亢進(jìn)或功能不足，進(jìn)而導(dǎo)致 5-HT 濃度改變。急性應(yīng)激使皮層、海馬，及杏仁核 5-HT 和其代謝產(chǎn)物 5-HIAA 的含量顯著增加；慢性應(yīng)激皮層 5HT 及 5-HIAA 逐漸恢復(fù)到或低于應(yīng)激前水平。大鼠在 3 h 急性運動后或 8 周跑臺運動后，大腦 5-HT 的水平都升高。微透析研究發(fā)現(xiàn)，60  min跑臺運動后，大鼠海馬的 5-HT 水平升高。另外，研究表明，大鼠興奮水平與腦內(nèi) DA 釋放成正相關(guān)，重復(fù)應(yīng)激后動物海馬 DA 水平降低。運動使大鼠前額皮質(zhì)、海馬和紋狀體的 DA 水平及其代謝物水平都有所增加。因此，之前的研究似乎表明海馬神經(jīng)元與情緒的興奮、抑制平衡有關(guān)系。

在本研究中，對應(yīng)激組被試小鼠不同腦區(qū)中單胺類遞質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)，5-HT、DA 及 NE 在大部分腦區(qū)中含量均有所降低，部分結(jié)果與之前的研究結(jié)果相一致，說明束縛應(yīng)激是易復(fù)制的應(yīng)激動物模型。第 1，本研究證明了束縛應(yīng)激可以使小鼠焦慮和抑郁行為增加；第 2，本研究的結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激降低了小鼠社交行為；最后，本研究發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激使小鼠不同腦區(qū)大多數(shù)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平下降�？偟膩碚f，本研究結(jié)果與之前束縛應(yīng)激小鼠模型結(jié)果相一致，證明本束縛應(yīng)激模型成功復(fù)制模擬壓力影響個體行為傾向性的模型。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)小鼠束縛應(yīng)激后會出現(xiàn)社交互動行為下降、焦慮及抑郁水平增加的情況。這些行為的改變可能與不同腦區(qū)抑制性與興奮性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)相關(guān)。更重要的是，運動干預(yù)可以緩解束縛應(yīng)激后的焦慮抑郁相關(guān)行為、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物水平的改變。這些結(jié)果說明周期為 2 周、每天 2 h 的慢性束縛應(yīng)激可能會使小鼠產(chǎn)生適度的焦慮抑郁行為，而運動干預(yù)卻降低了束縛應(yīng)激產(chǎn)生的這種變化。

大量研究證明運動可以用來緩解壓力造成的負(fù)性情緒及行為，提高認(rèn)知功能。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究用運動干預(yù)的方法來緩解壓力造成的焦慮、抑郁及社交相關(guān)行為的改變。本研究結(jié)果說明運動緩解了應(yīng)激造成的多種行為學(xué)及生物學(xué)的變化。部分結(jié)果與之前的相關(guān)研究結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步深入研究。