抗郁丸對CUMS抑郁癥大鼠行為學(xué)及機(jī)理的影響

摘要：目的 研究抗郁丸對慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）抑郁癥大鼠行為學(xué)及血清中甲狀腺激素、細(xì)胞因子的影響，探討抗郁丸治療抑郁癥的作用機(jī)理。

方法 采用慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)方法構(gòu)建CUMS大鼠模型。60只雄性大鼠隨機(jī)分為正常組（10只）和模型組（50只），模型組造模3周后，隨機(jī)分為模型對照組、丙咪嗪組及抗郁丸低、中、高劑量組，每組10只，記錄大鼠體重及糖水消耗量變化，并進(jìn)行開場行為檢測、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及懸尾實(shí)驗(yàn)。給藥8周后處死大鼠，腹主動脈取血，分離血清，測定大鼠血清中甲狀腺激素及細(xì)胞因子含量。

結(jié)果 模型對照組大鼠體重增長減慢，糖水消耗量減少，行為運(yùn)動得分降低，強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間及懸尾不動時(shí)間延長（P＜0．05），血清中四碘甲狀腺激素氨酸（T4）、促甲狀腺激素（TSH）含量降低（P＜0．05），白介素1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子（TNF－α）及IL－6含量升高（P＜0．05），與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？褂敉杓氨�咪嗪可加快模型大鼠的體重增長，增加糖水消耗量，增加行為學(xué)得分，縮短強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間及懸尾不動時(shí)間（P＜0．05），并提高血清中T4及TSH含量（P＜0．05），不同程度降低IL－1β、TNF－α及IL－6水平（P＜0．05），與模型對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論 抗郁丸能改善CUMS大鼠抑郁癥狀，逆轉(zhuǎn)抑郁癥大鼠血清中甲狀腺激素及細(xì)胞因子的含量，這可能是其發(fā)揮抗抑郁作用的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激；抑郁癥；甲狀腺激素；細(xì)胞因子

抑郁癥是一種由于身體某些器官功能紊亂或長期失落心境而引起的慢性應(yīng)激病理狀態(tài)，其發(fā)病率高、發(fā)病年齡廣泛，嚴(yán)重威脅人們的健康和生命，導(dǎo)致沉重的社會負(fù)擔(dān)。資料顯示，全球抑郁癥發(fā)病率為4．2％，中國高達(dá)6．9％，并且以11．3％的增長率逐年增加。據(jù)預(yù)測到2020年抑郁癥將上升為全球第二大疾病負(fù)擔(dān)。因此，對抑郁癥發(fā)病機(jī)制及治療的探討成為世界關(guān)注的重點(diǎn)。目前臨床常用藥物包括三環(huán)類、四環(huán)類、神經(jīng)遞質(zhì)類抑制劑、單胺氧化酶抑制劑等，但由于副作用大、療效不理想、依從性差制約了臨床應(yīng)用。而抑郁癥是一種典型的生物、心理、社會等多因素作用導(dǎo)致的疾病，可引起人體多系統(tǒng)的病理反應(yīng)，因此多層次、多靶點(diǎn)的中醫(yī)治療具有一定的潛力和優(yōu)勢。根據(jù)傳統(tǒng)的疏肝解郁名方，我們開發(fā)出的抗郁丸以抗抑郁為主，兼有健脾理氣、養(yǎng)血柔肝、清熱除煩、養(yǎng)心安神之功效，本實(shí)驗(yàn)通過慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激（chronicunpredictablemildstress，CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)方式構(gòu)建大鼠抑郁癥模型，研究抗郁丸對抑郁癥的功效，并以三碘甲狀腺氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲狀腺氨酸（tetraiodothyronine，T4）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulatinghormone，TSH）以及白介素-1β（interleukin1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactorα，TNF-α）為觀測指標(biāo)，初步探討其作用機(jī)理。

1材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物造模及分組

選用SPF級健康雄性SD大鼠60只，體重（200±10）g，由中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號為SCXK（粵）2011－0029。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)體重隨機(jī)分為正常組（n＝10）和模型組（n＝50），正常組5只／籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中不受任何刺激，模型組單籠飼養(yǎng)，采用CUMS法，每天隨機(jī)進(jìn)行一種應(yīng)激：禁食（24h）、禁水（24h）、夾尾（1min）、晝夜顛倒、潮濕墊料（墊料：水＝1∶1）、鼠籠傾斜（45°）、冰水游泳（4℃，5min）、合籠（5只／籠，24h），前后兩天刺激不能相同，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生種類，避免產(chǎn)生適應(yīng)現(xiàn)象。造模3周后，將模型組大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為模型對照組（雙蒸水5ml／kg）、丙咪嗪組（15mg／kg）、抗郁丸低劑量組（144mg／kg）、中劑量組（288mg／kg）、高劑量組（576mg／kg），每組10只，各組每日灌胃一次，從第4周開始，連續(xù)給藥8周，給藥同時(shí)繼續(xù)進(jìn)行刺激。

1．2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

抗郁丸，由無限極（中國）有限公司研發(fā)中心提供的復(fù)合藥，0．6g／片，主要成分為當(dāng)歸、川芎、陳皮、香附、白芍。低、中、高劑量組大鼠的給藥劑量分別按照相當(dāng)于成人使用量的0．5倍、1倍、2倍計(jì)算，配置成相應(yīng)濃度的混懸液（144、288、576mg／kg），4℃冰箱保存?zhèn)溆�。丙咪嗪（廣州市天騏生物科技有限公司），劑量15mg／kg，蔗糖（廣州輝旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），用大鼠日常飲用水配置成1％濃度溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。T3ELISA檢測試劑盒、T4ELISA檢測試劑盒、TSHELISA檢測試劑盒、IL-1βELISA檢測試劑盒、TNF-αELISA檢測試劑盒、IL-6ELISA檢測試劑盒（廣州市一科生物科技有限公司）。開場實(shí)驗(yàn)敞箱（100cm×100cm×40cm）、強(qiáng)迫游泳玻璃缸（35cm×35cm×50cm）由上海欣軟信息科技有限公司定制；電子分析天平（MettleToledo，Swiss），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，Germany），Elx800酶聯(lián)免疫檢測儀（ELX800Bio-TecInstruments）。

1．3 各種行為學(xué)檢測

1．3．1體重測量與糖水消耗量測量

于同等條件下每周進(jìn)行1次體重及糖水消耗量測定。適應(yīng)性飼養(yǎng)的1周對大鼠進(jìn)行1％糖水偏好訓(xùn)練，每籠并排放置2個(gè)水瓶，兩瓶均為糖水放置24h，隨后一瓶糖水，一瓶純水放置24h，再經(jīng)過24h禁食禁水后，進(jìn)行第一次糖水消耗量基線測定，造模開始后的每周在固定時(shí)間測定一次，測定時(shí)均為單籠。以1h糖水消耗量為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1．3．2開場行為實(shí)驗(yàn)

于造模前、造模3周后、給藥8周后用開場實(shí)驗(yàn)箱進(jìn)行行為學(xué)觀察。開場實(shí)驗(yàn)箱100cm×100cm×40cm，周壁為黑色，底面用白線劃分為面積相等的25個(gè)小方格。將單只大鼠置于光潔開場實(shí)驗(yàn)箱中央，以動物穿越地面方塊數(shù)為水平運(yùn)動得分（四爪均進(jìn)入的方格才計(jì)數(shù)），以直立次數(shù)為垂直運(yùn)動得分（兩前爪騰空或攀附周壁），以4min內(nèi)大鼠行為學(xué)得分為評價(jià)指標(biāo)。

1．3．3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

在大鼠造模前、造模3周后、給藥8周后在同等條件下進(jìn)行，共3次。取一強(qiáng)迫游泳玻璃缸，加水深30cm左右，水溫穩(wěn)定在室溫，將大鼠輕放水中適應(yīng)2min后連續(xù)觀察4min，以4min內(nèi)大鼠累計(jì)漂浮不動時(shí)間為評價(jià)指標(biāo)。

1．3．4懸尾實(shí)驗(yàn)

在大鼠造模前、造模3周后、給藥8周后在同等條件下進(jìn)行，共3次。將SD大鼠尾端2cm處固定于水平面上，使其呈倒掛狀態(tài)，頭部離臺面約30cm，四周以板隔離動物視線，適應(yīng)2min后觀察4min內(nèi)的累計(jì)不動時(shí)間（不動指標(biāo)為大鼠除呼吸外所有肢體均不動）。

1．4血清中甲狀腺激素及細(xì)胞因子含量測定

大鼠于連續(xù)給藥8周后，采用腹主動脈取血5ml，4℃10000r／min離心10min，分離血清，置于－80°冰箱保存待測，采用ELISA方法檢測血清中T3、T4、TSH及IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩分析采用LSD檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

20世紀(jì)60年代開始，人們針對抑郁癥發(fā)病機(jī)制的中樞神經(jīng)遞質(zhì)假說，試圖通過藥物誘發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂來建立相應(yīng)的動物模型，主要包括有5-羥色胺酸（5-HTP）誘導(dǎo)甩頭行為、利血平拮抗模型、高劑量阿撲嗎啡拮抗模型等，但藥物誘導(dǎo)的抑郁模型與人類抑郁癥的發(fā)病機(jī)制相差甚遠(yuǎn)，且抑郁癥狀較單一。情志異常是抑郁癥的主要病因，情志病因的實(shí)質(zhì)是不良生活事件形成的心理應(yīng)激，因此用慢性心理應(yīng)激的方法制作抑郁癥模型比較符合臨床實(shí)際，本實(shí)驗(yàn)參考Willner等提出的慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激程序并加以改進(jìn)，結(jié)合孤養(yǎng)方式構(gòu)建大鼠CUMS抑郁癥模型，這與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激源導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制更接近，糖水消耗是衡量動物對獎(jiǎng)賞的敏感缺乏和快感消失的客觀有效指標(biāo)，抑郁癥臨床表現(xiàn)雖復(fù)雜多樣，但其核心癥狀的實(shí)質(zhì)是快感缺乏，糖水消耗量的減少，不僅較好地模擬人類抑郁癥的核心癥狀，而且操作簡便，重復(fù)性好，較敏感。研究結(jié)果顯示，造模3周后，模型組大鼠糖水消耗量減少，體重增長緩慢，各種行為出現(xiàn)異常改變，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為CUMS抑郁癥模型造模成功，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。經(jīng)過抗郁丸連續(xù)8周的治療，抑郁癥大鼠的糖水消耗量增加，體重增長加快，抑郁行為得以一定改善，說明抗郁丸對CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠具有一定的抗抑郁功效。甲狀腺功能和抑郁癥的關(guān)系一直受到人們的關(guān)注，但結(jié)論尚不明確。Whybrow等學(xué)者提出甲狀腺功能與抑郁癥有關(guān)，該學(xué)說指出甲狀腺功能低下者，血中T3、T4含量下降，可降低抑郁癥發(fā)生的閾值，更易發(fā)生抑郁。陳丹等在探討甲狀腺功能亢進(jìn)與抑郁癥關(guān)系的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，在甲亢初期，T3、T4水平較高時(shí)患者表現(xiàn)為高代謝癥，抑郁癥的發(fā)病率極低，在甲亢的治療過程中，隨著病情的好轉(zhuǎn)，血清中T3、T4水平下降，抑郁癥的發(fā)病率由6．8％增加至51％，進(jìn)一步治療后，甲狀腺水平正�；蚱�低，甚至出現(xiàn)甲狀腺減退時(shí)，抑郁癥的發(fā)病率超過50％，表明甲狀腺激素的動態(tài)下降參與抑郁癥的形成及病程變化。而趙博等實(shí)驗(yàn)表明抑郁癥大鼠血清T4、TSH呈升高趨勢；陳寶忠等研究顯示抑郁大鼠T4含量降低，T3、TSH無明顯差異；佟海英等研究中，抑郁癥大鼠T3含量升高，TSH含量降低；本實(shí)驗(yàn)中模型對照組大鼠血清中T4、TSH含量降低，抗郁丸可上調(diào)降低的T4、TSH水平。

甲狀腺激素水平與抑郁癥之間不一致的研究結(jié)論，折射出兩者之間復(fù)雜的相關(guān)性，而甲狀腺激素水平高低不一，除了與甲狀腺激素自身的分泌調(diào)節(jié)受多種因素影響相關(guān)外，還可能與實(shí)驗(yàn)動物種屬和性別、造模刺激方式和強(qiáng)度、造模時(shí)間、采血時(shí)間等因素有一定的關(guān)聯(lián)性。“抑郁癥的細(xì)胞因子假說”為探討抑郁癥的機(jī)制和治療抑郁癥提供了一個(gè)新的視角，越來越多證據(jù)表明細(xì)胞因子和抑郁癥的發(fā)生之間存在密切聯(lián)系。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對于非抑郁癥患者而言，抑郁癥患者外周血液中炎癥細(xì)胞因子呈高水平過表達(dá)狀態(tài)，經(jīng)治療后抑郁癥狀緩解時(shí)細(xì)胞因子含量降低趨于正常水平。Wang等研究表明，注射細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑的小鼠出現(xiàn)了體重下降、糖水消耗減少等抑郁樣行為，抗抑郁藥治療后其癥狀明顯好轉(zhuǎn)。Thierno等對心肌梗死后的抑郁大鼠進(jìn)行治療后，大鼠的抑郁病態(tài)明顯改善，同時(shí)血液中炎性細(xì)胞因子水平下降。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)檢測模型組抑郁大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6含量升高，抗郁丸治療后能有效降低IL-1β、TNF-α及IL-6的過表達(dá)，改善抑郁行為。細(xì)胞因子在抑郁癥的發(fā)生中可能的機(jī)制為：通過神經(jīng)內(nèi)分泌功能介導(dǎo)、通過神經(jīng)遞質(zhì)代謝介導(dǎo)、通過神經(jīng)元細(xì)胞的功能介導(dǎo)。過度激活的細(xì)胞因子進(jìn)入腦內(nèi)相應(yīng)區(qū)域，造成神經(jīng)內(nèi)分泌功能的紊亂、神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙等一系列異常改變，在抑郁癥的病理過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，抗郁丸能改善CUMS大鼠的抑郁癥狀，逆轉(zhuǎn)甲狀腺激素和細(xì)胞因子的異常水平，提示其可能是通過調(diào)節(jié)下丘腦－垂體－甲狀腺軸分泌功能、調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)從而發(fā)揮抗抑郁功效。