鉤吻素子對大鼠焦慮行為的影響

摘要 ： 目的 進一步明確鉤吻素子是否具有抗焦慮作用 。 方法 以大鼠高架十字迷宮實驗為動物模型 ， 評價鉤吻素子單次皮下注射給藥和連續(xù)皮下注射給藥的抗焦慮活性及特點 。 結(jié)果 鉤吻素子能顯著增加大鼠進入高架十字迷宮開臂次數(shù)和在開臂的停留時間百分率（P＜ ０ ． ０５ ，P ＜ ０ ． ０１） ； 鉤吻素子在實驗劑量下對大鼠自主運動活性無影響（P ＞ ０ ． ０５） 。 結(jié)論 鉤吻素子可能具有抗焦慮作用 。
關(guān)鍵詞 ： 鉤吻素子 ； 焦慮 ； 高架十字迷宮

焦慮癥（anxiety disorders）又名焦慮障礙，或者焦慮精神性疾病，是一類以發(fā)作性或持續(xù)性情緒焦慮和緊張為主要特征的精神性疾病。焦慮癥的發(fā)病率逐年上升，嚴重影響了人們的生活質(zhì)量。藥物治療是目前應(yīng)用最廣泛、最有效的治療手段。然而，經(jīng)典的一線抗焦慮藥在治療焦慮癥的同時，往往具有藥物依賴、鎮(zhèn)靜、性功能障礙等不良反應(yīng) ， 使其臨床應(yīng)用受到限制，因此，亟待研發(fā)有效安全的新型抗焦慮藥。鉤吻為馬錢科胡蔓藤屬植物 ，中國鉤吻盛產(chǎn)于閩、桂、浙等地，其主要成分為吲哚類生物堿，含有數(shù)十種生物堿單體，其中鉤吻素子（koumine）為國產(chǎn)鉤吻生物堿單體中含量最高的一種有效成分。本實驗室前期采用小鼠高架十字迷宮實驗和明暗穿梭箱測試方法，首次觀察到鉤吻素子具有顯著的抗焦慮作用。然而，鉤吻素子抗焦慮作用有待于在更多的焦慮動物模型上確證。本文擬在此基礎(chǔ)上， 采用單次給藥和連續(xù)給藥２種給藥方式，考察鉤吻素子在大鼠高架十字迷宮模型中的抗焦慮作用及其特點。

1 儀器與材料

1.1 儀器  XR-XG201型 大鼠高架十字迷宮（由上海欣軟信息科技有限公司提供）

1．2試藥鉤吻素子粉末，由本課題組分離純化，并經(jīng)高效液相色譜鑒定，質(zhì)量分數(shù)為９９．２％，臨用時用生理鹽水配成所需質(zhì)量濃度的溶液；地西泮注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號１０１０１８１，用生理鹽水配成所需質(zhì)量濃度的溶液，新鮮配制。

1．3動物清潔級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量１８０～２００g，許可證號：SCXK（滬）２０１２‐０００２，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。在光暗周期１２／１２h（光照時間８：００～２０：００）、恒濕度（５０％±５％）、恒溫（２４±２℃）環(huán)境飼養(yǎng)，自由進食和飲水，每２d換１次墊料，動物室保持安靜。實驗前７d每天撫摸大鼠１～２min，減少無關(guān)刺激對實驗的影響。給藥前１h將大鼠移至實驗室，使之熟悉環(huán)境，消除陌生環(huán)境對大鼠的影響。所有針對大鼠的實驗操作均遵守國際和本地實驗動物使用和保護委員會頒布的條例。

2方法

2．1動物分組及給藥大鼠隨機分為對照組（生理鹽水）、地西泮（diazepam，DZP）陽性對照組（０．５mg·kg－１）及鉤吻素子０．７５，１．５和３mg·kg－１劑量組，每組７～１９只大鼠，按０．００５mL·g－１頸背部皮下單次量注射給藥１h后，于９：００～１３：００進行行為學測試；另取大鼠隨機分為對照組（生理鹽水）、DZP組（０．５mg·kg－１）及鉤吻素子０．１８７５，０．７５，１．５和３mg·kg－１劑量組，每組７～１５例。０．００５mL·g－１，頸背部皮下注射給藥，每天１次，連續(xù)７d（其中DZP組則第１～６d給予等體積生理鹽水，第７d給予DZP０．５mg·kg－１），各組于d７末次給藥１h后于９：００～１３：００進行行為學測試。
2．2行為學測試將實驗動物迅速置于迷宮的中央開闊部，使其頭部正對其中一個開臂，通過上方的攝像機拍攝５min內(nèi)動物的活動情況，記錄下述指標：①封閉臂進入次數(shù)（closearmentry，CE）；②開放臂進入次數(shù)（openarmentry，OE）；③開放臂停留時間（openarmtime，OT）。通過以上行為學指標分別計算下列指標：動物進入開放臂和封閉臂的總次數(shù)（to‐talarmentries）；動物進入開放臂次數(shù)比例（OE％），即OE／（CE＋OE）×１００％；動物在開放臂停留時間比例（OT％：OT／總時間×１００％）。
2．3統(tǒng)計學處理采用SPSS１３．０forWindows軟件對實驗數(shù)據(jù)進行計算。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤（mean±S．E．M）表示，兩組間均數(shù)比較采用雙側(cè)t檢驗，多組數(shù)據(jù)間采用one‐wayANOVA方法進行統(tǒng)計處理，差異有顯著性時再用LSD‐posthoc進行統(tǒng)計分析。P＜０．０５為差異有統(tǒng)計學意義。

4討論
目前，焦慮動物模型包括各種改進型多達３０種以上，其根據(jù)行為模式主要包括兩大類：基于動物非條件反射的模型和基于條件反射（傳統(tǒng)學習模式）的模型。高架十字迷宮實驗（elevatedplus‐mazetest，EPM）是基于動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成的動物矛盾沖突狀態(tài)的原理，建立的非條件反射模型，是目前應(yīng)用最廣泛的檢測動物焦慮行為的經(jīng)典模型之一，在精神藥理學研究中應(yīng)用廣泛。隨著精神藥理學的發(fā)展，EPM除了用于大鼠、小鼠的焦慮行為，還可用于評價同屬于嚙齒類的其他動物焦慮行為，如豚鼠。評價藥物是否具有抗焦慮作用，需在多種模型上從多個角度驗證。因此，本文選用大鼠高架十字迷宮模型，進一步評價鉤吻素子的抗焦慮作用。在EPM中，動物進入開臂次數(shù)和在開臂滯留時間，充分地反映了動物的焦慮狀態(tài)，相比之下，總?cè)氡鄞螖?shù)則反映了動物的運動活性。同時，我們也發(fā)現(xiàn)基于動物非條件反射行為基礎(chǔ)建立的EPM模型，在整個實驗過程中很容易被實驗條件影響，例如：實驗動物的選擇（種屬、年齡、性別、健康狀態(tài)）、動物對環(huán)境的適應(yīng)、實驗條件基本保持一致（實驗操作者、燈光、氣味）、飼養(yǎng)條件、測試時間等。地西泮是經(jīng)典的苯二氮類抗焦慮藥物，其起效快，作用顯著，是焦慮動物模型中最常用的陽性對照藥之一，在單次給藥和連續(xù)給藥EPM模型中，我們均可觀察到地西泮能夠顯著提高動物開臂的進入次數(shù)以及在開放臂的停留時間，與文獻報道一致，說明模型穩(wěn)定。

有研究指出，北美鉤吻總生物堿在劑量為１５０mg·kg－１時，能顯著性地提高小鼠在高架十字迷宮中進入開放臂的次數(shù)和時間。在小鼠明暗穿箱實驗中發(fā)現(xiàn)，北美鉤吻總生物堿能顯著提高小鼠在明箱中的停留時間和明暗箱穿梭次數(shù)，顯示出顯著的抗焦慮作用。鉤吻生物堿單體鉤吻素甲和鉤吻素子在小鼠明暗穿箱模型中，也顯示出顯著的抗焦慮作用。此外，鉤吻素子與其他鉤吻生物堿單體相比，毒性相對較�。ㄐ∈�LD５０為９９．０mg·kg－１，sc），初步提示了鉤吻素子可能具有高效、低毒的抗焦慮作用。在此基礎(chǔ)上，本文采用大鼠高架十字迷宮為動物模型，從不同角度進一步探討鉤吻生物堿中鉤吻素子
的抗焦慮作用和特點。

文中結(jié)果提示，鉤吻素子在大鼠高架十字迷宮模型中呈現(xiàn)出與地西泮一致的抗焦慮作用，作用呈劑量依賴性。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在大鼠高架十字迷宮單次給藥和連續(xù)給藥時，鉤吻素子的抗焦慮作用并不是呈經(jīng)典的線性關(guān)系。其原因可能是鉤吻素子在一定范圍內(nèi)達到了抗焦慮作用的最大效應(yīng)，其抗焦慮作用不再隨著藥物劑量的增加而增強，所以出現(xiàn)與焦慮相關(guān)的腦區(qū)對高劑量鉤吻素子反而不敏感。由此可見，在應(yīng)用鉤吻素子抗焦慮時要嚴格控制其劑量。此外，我們還觀察到鉤吻素子對動物的運動活性并無顯著影響，說明其發(fā)揮抗焦慮作用的同時，無鎮(zhèn)靜催眠作用。
綜上所述，鉤吻素子可能有抗焦慮作用，并具有高效、低毒的特征，有望成為治療焦慮癥的新型藥物。鑒于焦慮動物模型的多樣性，其抗焦慮作用還有待于在更多的模型上確證，其抗焦慮作用的機制也有待探究。