牙齒正畸移動模型大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi) P2Y2和P2Y6的表達(dá)變化

【摘 要 】 目的：研究大鼠牙齒正畸移動模型下，三 叉 神經(jīng)節(jié)（trigeminal ganglion,  TG) 內(nèi)嘌呤受體P2Y2 和 P2Y6 的表達(dá)變化，以探討P2Y2 和 P2Y6 受體在正畸牙齒移動所致疼痛機(jī)制中的作用。方法：4 2 只 雄 性 SD 大鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組再按加力后12h 、ld 、2d 、3d 、5d 、7d不同時(shí)間段分為6 個(gè)亞組，每組 6 只。實(shí)驗(yàn)組模型大鼠以80 g 力作用于大鼠上頜左側(cè)第一磨牙，模擬臨床矯治的牙移動過程。之后在不同時(shí)間點(diǎn)采用曠場實(shí) 驗(yàn)和試嘴行為檢測大鼠發(fā)生疼痛的行為學(xué)表現(xiàn)，利用Western Blot方法檢測T G 內(nèi) P2Y2、P2Y6 的表達(dá)變化，并分析其與疼痛發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果：模型建立后，曠場實(shí)驗(yàn)檢測到一定的規(guī)律：即實(shí)驗(yàn)組大鼠前30s 通過的總線數(shù)、 5min內(nèi)通過的總線數(shù)、5min內(nèi)通過曠野中心的總線數(shù)、5m in內(nèi)抬起行為的總次數(shù)這四組參數(shù)從12h開始下降， 2d降至最低,后逐漸上升至7d與對照組基本一致。5min內(nèi)拭嘴行為的總時(shí)間自12h開始增高,2d升至高峰， 后逐漸下降至7d與對照組基本一致。Western  Blot檢測結(jié)果顯示:T G 內(nèi) P2Y2 和P2Y6蛋白的表達(dá)量自實(shí)驗(yàn)后12h開始逐漸升高至2 d 達(dá)到高峰，7 d 后下降至對照組水平。與對照組對比，1d、2 d 、3 d 組均有顯著性差異（P <0.05) 結(jié)論：在大鼠牙移動過程中，T G 內(nèi) P2Y2 和 P2Y6 的表達(dá)變化呈現(xiàn)短時(shí)程的上調(diào)規(guī)律，推測P2Y2和P2Y6與牙移動后的痛行為學(xué)表現(xiàn)密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】正畸牙移動;三叉神經(jīng)節(jié);疼痛；P2Y2; P2Y6; 大鼠

疼痛是正畸治療中常見的也是令正畸醫(yī)生棘手的問題之一 m ，探討口腔正畸疼痛的發(fā)生機(jī)制以及 尋求減輕或消除疼痛的方法是目前國內(nèi)外正畸領(lǐng)域 的研究熱點(diǎn)之一。三 叉 神 經(jīng) 節(jié) （trigem inal  ganglion, TG) 是外周感覺信息傳人中樞的初級感覺神經(jīng)節(jié)， 是感受頜面部傷害性刺激的重要結(jié)構(gòu)，在其神經(jīng)元上的一些核苷酸受體，可介導(dǎo)頜面部的傷害性感覺。三憐酸核昔（adenosine triphosphate，ATP) 已被發(fā)現(xiàn)作為信號分子在神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中起著中介作用，ATP通過激活P2受體會產(chǎn)生一系列生理效應(yīng)。P2 受 體 包 括 P2X ( 配體門控非選擇性陽離子通道受體）和 P2Y( G 蛋白偶聯(lián)受體）兩大類。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了P丨3  ,4, 8 種P2Y 受體亞型 。 W eick等研究發(fā)現(xiàn)P2Y2受體表達(dá)于大鼠的TG神經(jīng)元 內(nèi)。在受損的TG神經(jīng)元內(nèi)可觀察到P2Y 受體的表達(dá)量明顯增多，提示三叉神經(jīng)痛可能與P2Y 受體的表達(dá)有關(guān)。本研究擬通過大鼠牙齒正畸過程 中疼痛的產(chǎn)生與T G 內(nèi) P2Y2 和 P2Y, 表達(dá)變化的相關(guān)性分析來探討正畸牙齒移動過程中疼痛發(fā)生的外周機(jī)制，為進(jìn)一步研究P2Y2和P2Y6 受體在正畸疼痛機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)，也為研發(fā)新型的 頌面部鎮(zhèn)痛藥物提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1 . 1 實(shí)驗(yàn)動物及分組選8周齡雄性S D大鼠共42只（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，所有實(shí)驗(yàn)動物符合國際實(shí)驗(yàn)動物要求），體 重 200 ~ 250 g , 在安靜環(huán)境中飼養(yǎng)48h以上。隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組 ，實(shí)驗(yàn)組按加力后12h 、ld 、2d 、3d 、5d 、7d 不同時(shí)間段又分為6 個(gè)亞組，每 組 6 只 。1 - 2 模型建立采用7 % 水合氯醛 （0.4  ml/100g ) 腹腔注射麻醉大鼠，之后在上頜左側(cè)第一磨牙的牙頸部 、前牙唇面及軸角處磨出深約〇.2m m的固位溝 。將大鼠上頜左側(cè)第一磨牙和前牙間用0.02mm 結(jié)扎絲拴正畸 用 N i Ti螺 旋 彈 簧 （0.01  inch) 。為防止彈簧脫落，用樹 脂釉質(zhì)粘結(jié)劑將固位溝內(nèi)的結(jié)扎絲進(jìn)一步固定。測力計(jì)測力 ，建 立 80g 正畸力作用下的牙齒移動模型。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中忽略支抗的喪 失 ，實(shí)現(xiàn)以上領(lǐng)2 個(gè)中切牙為支抗，拉左側(cè)第一磨牙向近中移動，實(shí)驗(yàn)組分別于加力后丨2  h 、l  d 、2  d 、 3  d 、5  d 、7  d 六個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動物，對照組大鼠于7 cl處死 ，之后迅速取實(shí)驗(yàn)組和對照組左側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)。

2 方法

2 . 1 疼痛行為學(xué)檢測

2 . 1 . 1 曠場實(shí)驗(yàn)將大鼠置于箱中（由上海欣軟信息科技有限公司提供）， 每次1只。每 次均從箱子的右角開始 ，分別觀察各組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，同時(shí)記 錄以下參數(shù) ：每只大鼠前30S通過的總線數(shù)、5min內(nèi)通過的總線數(shù)、5min內(nèi)通過曠野中心的總線數(shù) 、5min內(nèi)抬起行為的總次數(shù)。注意當(dāng)大鼠4只爪子完全通過時(shí)才記為1條線。

2.1.2 拭嘴行為實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)大鼠放到箱中，每次一只，每只觀察5  min, 用錄像機(jī)分別記錄對照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠模型建立后 12h 、l  d 、2d 、3d 、5d 、7d 拭嘴行為反應(yīng) ，請未參加實(shí)驗(yàn)的觀察者統(tǒng) 計(jì)5min 內(nèi)大鼠拭嘴行為的總時(shí)間。

2.1.3 Western Blot檢測 P2Y2和P2Y6受體的表達(dá)變化腹膜腔注射 7%水合氯醛（280mg/ kg) ，深麻醉后將大鼠開胸，用〇.01tnol/ L 的 PB S溶液迅速沖去血液 、并于冰上快速取出左側(cè)TG，然后置人裝有蛋白酶抑制劑（PM SF)及組織裂解液（RIPA) 的EP 管 內(nèi) ，將 E P 管放于冰上使用超聲裂解儀充分勻漿組織 。充分勻裝后 12000  r/ m i n j T 離心15min。將上清液移人新的 1.5 mlEP 管內(nèi) ，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，確定含10 |x g 及以上的蛋白 上 樣體積 。蛋白樣品采用1 0 % 的SD S -P A G E 進(jìn)行電泳分離 ，加人預(yù)染蛋白 markei•，根據(jù)預(yù)染marker的位置確定所需蛋白 P2Y2 、P2Y6 及 p -a c tin 的位置，將膠上蛋白電轉(zhuǎn)到 P V D F膜上做免疫雜交反應(yīng)（P V D F 膜預(yù)先用甲醇溶 液 浸 泡 I  m in激活 ）。用 含 5 % 脫脂奶粉封閉2  h , 分別加入兔抗  P2Y2  Ig G( 1:200; Alomone  Labs . Jeru­salem)  ' 兔抗 P2Y6  Ig G( 1 : 200; Alonione  Lahs’Jerusa- lem ) ，4 t 孵 育 過 夜 后 使 用 TBS-T 洗 膜 10  min  x 3 次 ，加 人 H R P 結(jié) 合 的 驢 抗 兔 Ig G(  l : 5〇00;中杉，北京 ），室 溫 下孵育1  h ; TBS-T 洗 膜 10  min x 3 次后，在Bk>-Racl成像系統(tǒng)中滴加化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行熒光條帶掃 描 ，Image  L a b 軟 件 分 析 熒 光 密 度 值 。依次使用 Stripping  Buffer 洗膜 30  m in、PBS 洗膜 10  min X 2 次 、 TBS-T 洗 膜 5  m in后 ，用 含 5 % 脫脂奶粉封閉2  h ，加人小鼠抗 P-a(‘tin  Ig G ( 1: 5000 ; Sigma, Germany) ，4 °C 孵育過夜后使用 TBS-T洗膜10 min x 3 次 ，加人H R P結(jié)合的驢抗小鼠 Ig G( l :5 0 0 0 ;中杉，北 京 ），室溫下孵育1 h ;TBS-T洗膜 10  min  x 3 次 后 ，在 Bio- Rad 成 像系統(tǒng) 中滴加 化學(xué)發(fā) 光液進(jìn) 行熒光 條帶掃描 , Im age L ab軟件分析熒光密度值。以 P2Y2、P2Y6 及 p -actin 的熒光密度值之比計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組大鼠與對照組大鼠的相對蛋白表達(dá)量。統(tǒng)計(jì) 學(xué)處理 ：使用 SPSS19. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 ，用 《檢驗(yàn)比較對照組與實(shí)驗(yàn)組的行為學(xué)指標(biāo)及P2Y2 與 P2Y6的表達(dá)差異 ，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ( x ± s ) 表示 ，采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異的比較，以P <0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討  論

疼痛是正畸治療過程中的一個(gè)常見反應(yīng) ，與其他急性損傷相比 ，正畸治療中產(chǎn)生的疼痛具有周期短和強(qiáng)度低的特點(diǎn)。正畸疼痛不僅是一個(gè)復(fù)雜的生理問題 ，它還是一個(gè)心理的行為問題，影響正畸疼痛的因素有很多，包括醫(yī)源性因素和個(gè)體因素 。醫(yī)源性因素是指臨床中使用不同的矯治方法 、不同的矯治器 、不同類型的弓絲等，都會對正畸疼痛產(chǎn)生不同的影響；而個(gè)體因素包括患者的年齡、性 別 、心理 、情緒 、注意力和遺傳等諸多因素, 還有研究表明人們對疼痛的反應(yīng)也會受到不同社會文化背景的影響。不同國家的正畸醫(yī)生曾對于正畸過程中是否存在疼痛以及正畸疼痛與上述因素的相關(guān)性等問題進(jìn)行過研究 ，但這些研究均來自于臨床 ，患者的主觀 感受多 ,影響因素頗復(fù)雜，結(jié)論亦不盡相同。因此 ，本研究試圖通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究P2Y ，和 P2Y6受體在正畸疼痛及頜面部疼痛機(jī)制中的作用。

牙齒正畸移動模型建立后，實(shí)驗(yàn)組大鼠表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激水平降低和試嘴行為的增多 ，后逐漸恢復(fù)至對照組水平 。此趨勢與Yozgatian等的研究結(jié)果基本一致。正畸快速擴(kuò)弓時(shí)每旋轉(zhuǎn)螺旋擴(kuò)大器 1 / 4 圈會產(chǎn)生2000 g 左右的力 ，根據(jù)大鼠牙齒是人類牙齒的 1 /2 0 計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)選擇80g力施加在大鼠磨牙上以模擬臨床施加于患者的正畸重力，此力值未超過臨床使用力值范圍。本實(shí)驗(yàn)剔除了對牙齒正畸移動模型不敏感的大鼠。Y ang等已通過實(shí)驗(yàn)證明空白對照組與陰性對照組各行為反應(yīng)變化無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故本實(shí)驗(yàn)未設(shè)置陰性對照組。

在正畸力作用下，牙周膜內(nèi)出現(xiàn)張力區(qū)和壓力區(qū) ，即使使用輕微的力量 ，也能造成牙周組織的損傷 。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組P2Y2和P2Y6 受體的表達(dá)變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性：模型建立后12h 開始逐漸增加，2 d 表達(dá)量達(dá)到峰值 ，自3d開始表達(dá)量逐漸減 少 ，7d 時(shí)受體表達(dá)量幾乎與對照組無異。鄭 衍亮等臨床研究發(fā)現(xiàn)：牙周疼痛發(fā)生時(shí)間在正畸加力后1 ~丨2 h不等 ，平均為4 ~ 5 h , 在2 4 ~ 4 8 h 疼 痛達(dá)到最高峰 ，加力后72h 疼痛程度才逐漸減 輕 。由此可以看出，本研究觀察到的TG內(nèi)P2Y2和P2Y6的變化規(guī)律與實(shí)際臨床中所見的患者的疼痛規(guī)律呈一定的相似性。

生理學(xué)研究表明，頭面部的傷害性信息是由TG內(nèi)中等大小（600  ~  1200pm2) 和小神經(jīng)元（<600 (jun* ) 傳人的。Rodrfguez-Zayas  等曾報(bào)道 ，脊髓損傷后P2Y2的表達(dá)量在損傷2d后明顯上調(diào)，直

至恢復(fù)正常 。M alin等報(bào)道 :敲除P2Y2 受體的小鼠對熱痛存在 缺陷 。L i等h 5j 研 究 證 明 ，抑制P2Y2 受 體 對三 叉 神 經(jīng) 痛模 型大 鼠可 以起到 鎮(zhèn)痛作用 。以上實(shí)驗(yàn)均證實(shí)P2Y2在疼痛的形成及外周向中樞傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。有研究報(bào)道 ，正畸矯治力使牙齒一側(cè)組織受壓另一側(cè)受牽張，損傷可導(dǎo)致ATP釋 放 ，作用于P2Y2和P2Y6受體并通過第二信引起IP3敏感鈣庫的 Ca2+釋放 ，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的功能。本研究觀察到P2Y2和

P2Y6的表達(dá)量在模型建立3d后開始出現(xiàn)降低 ，我們推測可能是 局部組織已逐漸適應(yīng)外界刺激的原因 ，也說明P2Y2和P2Y6的表達(dá)變化可隨刺激而變化，是短時(shí)間的效應(yīng)，不是一個(gè)持續(xù)的變化，也印證了牙移動的一過性疼痛規(guī)律 ，與臨床研究結(jié)果相符 ，提示 P2 Y2和 p2y6的表達(dá)在牙移動疼痛中可能發(fā)揮重要作用。 曹陽等研究 發(fā)現(xiàn) , T G 內(nèi) P2X, 在實(shí)驗(yàn)性大鼠牙齒移動時(shí)表達(dá)呈上調(diào)趨勢，其 表達(dá)在刺激后4 h開始增加,3d 時(shí)達(dá)到高峰，7d后下降至與對照組基本一致。本實(shí)驗(yàn)對P2Y受體兩個(gè)亞型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，P2Y2和P2Y6受體表達(dá)量高峰出現(xiàn)在2d , 較P2X3峰值出現(xiàn)早 ，是否是因?yàn)镻2Y 受體家族較P2X受體家族能對傷害性刺激做出更迅速的反應(yīng)，目前尚不十分清楚，需要進(jìn)行深人研究。本實(shí)驗(yàn)還觀察到P2Y2受體的 表達(dá)變化要比P2Y6略明顯，推測P2Y2在致痛過程中可能較P2Y6 具有更重要的作用，而P2Y6是否在P2受體家族中起“先鋒”作 用 ，以及P2Y6受體的激活是否對P2Y2受體的激活有一定的積極作用仍有待進(jìn)一步深人研究。