紫果西番蓮葉提取物抗焦慮作用及其機制

摘要目的探討紫果西番蓮葉提取物的抗焦慮作用及其機制。方法60只小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組和提取物大、中、小劑量組共5組。提取物大、中、小劑量組分別灌胃紫果西番蓮提取物800，400，200 mg·kg～·d～，陽性對照組給予地西泮2 zng·kg～·d～，空白對照組灌胃等容積1％羧甲基纖維素鈉，各組連續(xù)給藥7 d。以高架十字迷宮(EPM)實驗為動物模型，考察紫果西番蓮葉的抗焦慮活性；用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法對擴增產(chǎn)物進行分析。結(jié)果紫果西番蓮葉醇提物(400，800 rng·kg-�！�d-1)能增加小鼠在開臂內(nèi)運動時間和次數(shù)百分率，并且提高小鼠在開場中央?yún)^(qū)的次數(shù)；實時熒光定量PCR法分析表明，紫果西番蓮葉醇提物(400，800 rng·kg一·d_1)能上調(diào)EPM焦慮小鼠腦組織中GABAA受體0【，亞型和0【，亞型mRNA表達水平。結(jié)論 紫果西番蓮葉醇提物具有明顯的抗焦慮作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)GABA^受體d2亞型和僅，亞型mRNA表達水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞紫果西番蓮葉；焦慮；高架十字迷宮；1一氨基丁酸A型受體

紫果西番蓮(P．edu紜Si琊)，別名百香果，為西番蓮科(P0ss坍omce口e)西番蓮屬(幾黜耖％m L．)藤本植物，目前在我國臺灣、廣東、福建、廣西和云南等省區(qū)均大量栽培。西番蓮全草均可人藥，對于神經(jīng)痛、一般性癲癇發(fā)作、癔病、間歇性哮喘、更年期綜合征、心律失常、高血壓有很好的療效。在熱帶國家普遍用作民間治療用藥，在歐洲更是頗負盛名，適用于治療睡眠失調(diào)和焦慮不安等多種疾病，然而筆者尚未見國內(nèi)紫果西番蓮抗焦慮作用的研究報道。由此，筆者在本研究對紫果西番蓮葉的抗焦慮作用進行實驗研究。

1材料與方法

1．1動物健康雄性昆明種小鼠60只，級別：sPF，初始體質(zhì)量20～25 g，合格證號：scxK(粵)2008旬002，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。小鼠飼養(yǎng)于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物實驗室sPF動物房。光照節(jié)律12L：12D(7：00～19：oo)，室溫(18±2)℃，相對濕度約50％，動物可以自行攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔飲用水。

1．2 藥物與試劑 紫果西番蓮葉采自廣東梅州五華縣，經(jīng)華南植物研究所韋強老師鑒定為西番蓮屬西番蓮科植物紫果西番蓮(P∞s汐om edu玩Si郴)的干燥葉；羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose，cMc)；地西泮(上海信誼醫(yī)藥公司，批號：10021122)；Trizol試劑(TaKaRa Code：D9108A)；焦碳酸二乙酯(DEPc，廣州威佳科技有限公司)；D12000 DNAMarker(大連寶生物有限公司)；EB溶液(上海申能博彩生物公司)；M．MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(nvitrogen)；sYBRPremix Ex Taq’M(TaKaRa)；Loading Bufkr(TaKaRa)。引物合成和測序由上海捷瑞生物科技公司完成。

1．3儀器小鼠高架十字迷宮(由上海欣軟信息科技有限公司提供)；NAN0 DROP 2000；恒壓電泳儀(北京六一儀器廠)；恒溫水浴槽(上海精宏實驗設(shè)備公司)；GeneQ基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)；熒光定量PcR儀(Qiage n、公司)；凝膠成像系統(tǒng)(universal Hood)Ⅱ(Bio-Rad公司)。

1．4溶液的制備取紫果西番蓮葉粗粉160 g，用15倍量的60％乙醇80℃回流提取3次，每次2 h，合并濾液，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓干燥得紫果西番蓮葉醇提物，臨用前用1％CMc進行溶解。地西泮用1％CMc配成o．125 mg·mL‘1溶液，4℃保存，使用前混搖均勻。

1．5動物分組與給藥方法將小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組和紫果西番蓮提取物大、中、小劑量組共5組。其中紫果西番蓮提取物大、中、小劑量組分別按800，400，200 mg·k～·d。1灌胃給藥¨1，陽性對照組給予地西泮2 mg·kg～·d～，空白對照組灌服等容積1％cMc。各組連續(xù)給藥7 d，于第7天在末次給藥1 h后8：00～16：00進行行為測試。

1．6 小鼠高架十字迷宮(EMP)實驗高架十字迷宮包括兩個開臂(長30 cm，寬5 cm)與兩個閉臂(長30 cm，寬5 cm，高15 cm)距地面50 cm。迷宮測試前將每只小鼠放人一個50 cm×50 cm×40 cm曠場箱中，任其自由探究5 min后迅速置于EPM的中央平臺處，使其頭部正對其中1個開放臂，記錄5 min內(nèi)小鼠進入開臂次數(shù)、閉臂次數(shù)和迷宮中央?yún)^(qū)內(nèi)的次數(shù)及在開臂與閉臂的運動時間。以進人開臂次數(shù)與總?cè)氡鄞螖?shù)的百分率及在開臂內(nèi)運動時間與人臂總時間百分率代表抗焦慮作用指標(biāo)。整個行為過程用Supermaze軟件實時分析實時監(jiān)測。每測試完一只用濕布擦拭迷宮，清除糞便，用干布擦拭干凈后再進行下一只小鼠的測試。

1．7 鼠腦組織中1一氨基丁酸A型(GABA。)受體僅2和僅，亞型mRNA表達的檢測 小鼠EPM行為學(xué)測試結(jié)束后，立即處死，每組分別取5只小鼠的腦組織，無菌條件下分離全腦，將腦組織置于預(yù)冷的研缽中，在液氮條件下?lián)v碎成粉末，按試劑盒說明用TRIz01試劑提取腦組織總RNA，用1％瓊脂糖凝膠電泳來鑒定RNA的完整性后，用半定量RT—PcR方法檢測GABA。受體d：亞型和0【，亞型mRNA水平的表達，以B—actin作為內(nèi)參照，僅2亞型上游引物5’一GcTAcGC吼～C—ACAACCTC一3’，下游弓I物5 7一TCA7ITGAC711ACACT—C1Trcc．3’；o【，亞型上游引物5’．CAACTAC rITIICACcAAGCGG．3 7，下游弓l物5’．CGGGAAATrITGTCAACCT一37；PcR反應(yīng)條件：94℃5 min預(yù)變性，94℃30 s，53．6℃30 s，72℃45 s，擴增38個循環(huán)，72℃延伸7 min，PcR產(chǎn)物進行3％瓊脂糖凝膠電泳。Real—timePcR 分析：僅：亞型上游引物 5 7一AATcT—GGACTCCTGA‘rACCTTC．3’，下游弓I物5 7一CATTCGGcTTGGAcTGTAAG一3 7；d，亞型上游引物5’一AAGT—GCACAGGATGGCTCACG一3’，下游弓l物5’一ACATGG—CAAGTAGGTCTGGATGAC-3 7；Real-time PCR反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用PcR儀軟件分析反應(yīng)結(jié)果，檢測各樣本中的c。值，以Delta—delta c。法分析各組GABA。受體僅2亞型和儀，亞型基因相對表達量。

1．8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用sPSsl8．o版for windows統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(孑±s)表示，采用單因素方差分析(one—wayANOVA)進行檢驗。P<o．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3討論
紫果西番蓮在巴西民間作為治療焦慮癥的藥物，文獻研究表明，紫果西番蓮提取物與地西泮的不同之處是在抗焦慮的同時，不阻斷記憶過程。本研究采用RT—PCR和Real-time PCR兩種方法對紫果西番蓮葉提取物是否通過GABA。型受體僅：亞型和僅，亞型來發(fā)揮抗焦慮作用進行了探討，結(jié)果顯示800及400 mg·kg～·d一的紫果西番蓮葉提取物相對于空白對照組，僅：亞型和儀，亞型mRNA的相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)，提示紫果西番蓮提取物的抗焦慮作用與GABA．型受體有關(guān)。