Ｄ －絲氨酸對杏仁核區(qū) ＮＭＤＡ 受體恐懼消退的作用

【摘要】 目的 探討條件性恐懼與消退模型小鼠杏仁核區(qū) Ｄ－絲氨酸代謝酶的變化及外源性 Ｄ－絲氨酸和ＮＭＤＡ 受體阻斷劑 ＭＫ－８０１ 對恐懼消退的影響及 Ｄ－絲氨酸抗焦慮作用的可能機制。 方法 （１）將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為空白對照組、條件性恐懼組、消退訓(xùn)練組、消退檢測組，每組 ６ 只，對照組不給予聲音及電刺激，其余每組分別進行條件性恐懼、消退訓(xùn)練、消退檢測等相應(yīng)的實驗步驟后取雙側(cè)杏仁核區(qū)組織提取蛋白進行 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 檢測。（２）將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ３ 組：對照組（Ｆ）、Ｄ－絲氨酸組（Ｆ）、ＭＫ－８０１組（Ｆ），每組 ８ 只，于消散訓(xùn)練前 １ ｈ分別腹腔注射生理鹽水、Ｄ－絲氨酸 １０００ ｍｇ ／ ｋｇ 及ＭＫ － ８０１ ０暢 １ｍｇ／ ｋｇ。（３）Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ３ 組：對照組（Ｘ）、Ｄ－絲氨酸組（Ｘ）、ＭＫ － ８０１ 組（Ｘ），每組 ８ 只，于消散訓(xùn)練前 １ ｈ 分別杏仁核區(qū)注射生理鹽水、Ｄ－絲氨酸 ４μ ｇ ／ 側(cè)、ＭＫ － ８０１ ０.１ μ ｇ／側(cè)。（４）應(yīng)用高架十字迷宮探討 Ｄ －絲氨酸對焦慮行為的影響。 結(jié)果 （１）與空白對照組比較，消退訓(xùn)練組及消退測試組杏仁核區(qū)絲氨酸消旋酶的表達下降，Ｄ －氨基酸氧化酶表達上調(diào)。（２）Ｄ －絲氨酸組（Ｆ）木僵行為低于對照組（Ｆ），ＭＫ － ８０１ 組（Ｆ）高于對照組（Ｆ）及 Ｄ －絲氨酸組（Ｆ）（P ＜ ０.０５）。 （３）Ｄ －絲氨酸組（Ｘ）的木僵行為少于對照組（Ｘ），ＭＫ － ８０１ 組（Ｘ）多于對照組（Ｘ）和 Ｄ －絲氨酸組（Ｘ）（P ＜ ０.０５）。 （４）Ｄ －絲氨酸組小鼠在高架十字迷宮中開放臂時間百分比高于對照組（P ＜ ０.０５）。結(jié)論 Ｄ －絲氨酸的抗焦慮作用很可能與激活杏仁核區(qū) ＮＭＤＡ 受體促進恐懼記憶消退有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 杏仁核；Ｄ－絲氨酸；恐懼消退

焦慮癥是以廣泛和持續(xù)性焦慮不安或反復(fù)發(fā)作的驚恐為主要特征精神心理性疾病。 恐懼消退受損是焦慮癥狀持續(xù)存在的主要原因。 ＮＭＤＡ 受體是谷氨酸受體的亞型，大量研究表明 ＮＭＤＡ 受體在恐懼消退中起著重要的調(diào)節(jié)作用。 Ｌ －絲氨酸在絲氨酸消旋酶（ｓｅｒｉｎｅ ｒａｃｅｍａｓｅ，ＳＲ）的作用下轉(zhuǎn)化為 Ｄ －絲氨酸，Ｄ －氨基酸氧化酶（ Ｄ －ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ，ＤＡＡＯ）是 Ｄ －絲氨酸的主要代謝酶。 ２０１３ 年 ６ 月至 ２０１４ 年 ９ 月，本研究通過條件性恐懼與消退模型小鼠杏仁核區(qū) Ｄ －絲氨酸代謝酶的變化及外源性 Ｄ －絲氨酸和 ＮＭＤＡ 受體阻斷劑 ＭＫ － ８０１ 對恐懼消退的影響，研究 Ｄ －絲氨酸抗焦慮作用的可能機制。

１ 材料與方法

１．１ 實驗藥物 Ｄ －絲氨酸、ＭＫ － ８０１、ａｎｔｉ －ＳＲ ａｎｔｉ-ｂｏｄｙ、ａｎｔｉ －ＤＡＡＯ ａｎｔｉｂｏｄｙ、β－ａｃｔｉｎ、二抗均購買于Ｓｉｇｍａ 公司。

１．２ 實驗動物及分組 Ｃ５７ＢＬ／ ６Ｊ 雄性小鼠（Ｃ５７）７２只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供），９ ～１０ 周齡，體重 ２０ ～２５ ｇ，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境（環(huán)境溫度２４ ～ ２７℃，自由獲得食物和水），光照周期 １２ ｈ。 （１）實驗１：將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ４ 組：空白對照組、條件性恐懼組、消退訓(xùn)練組、消退檢測組，每組 ６ 只，空白對照組不給予聲音及電刺激，其余每組分別進行相應(yīng)的實驗步驟按１.３ 進行，結(jié)束后分別在模型后 １ ｈ 用取雙側(cè)杏仁核區(qū)組織提取蛋白進行 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 檢測。 （２）實驗 ２：將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ３ 組：對照組（Ｆ）、Ｄ －絲氨酸組（Ｆ）、ＭＫ － ８０１ 組（Ｆ），每組 ８ 只，于消散訓(xùn)練前 １ｈ 給藥，分別腹腔注射生理鹽水、Ｄ －絲氨酸 １ ０００ ｍｇ／ｋｇ 及 ＭＫ－８０１ ０.１ ｍｇ ／ ｋｇ。 （３）實驗 ３：將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ３ 組：對照組（Ｘ）、Ｄ －絲氨酸組（Ｘ）、ＭＫ － ８０１組（Ｘ），每組 ８ 只，于消散訓(xùn)練前 １ｈ 給藥，分別杏仁核區(qū)注射生理鹽水、Ｄ－絲氨酸 ４ μ ｇ ／ 側(cè)、ＭＫ －８０１ ０.１μ ｇ／ 側(cè)。
１．３ 條件性恐懼及消退訓(xùn)練模型的建立 實驗裝置為底邊有導(dǎo)電的小鐵柱有機塑料容器（由上海欣軟信息科技有限公司提供，型號XR-XC404）。 第 １ 天實驗為恐懼學(xué)習(xí)記憶形成，將小鼠放入容器內(nèi)適應(yīng) ３ ｍｉｎ。 然后連續(xù)進行 ４ 組訓(xùn)練，每組訓(xùn)練包括：３０ ｓ 的聲音刺激（８０ ｄＢ），聲音刺激的最后 ２ ｓ 給電流刺激（０.５ ｍＡ），每組間隔 ３０ ｓ。 第 ２ 天為恐懼記憶消散訓(xùn)練，將小鼠放入另一個貼有黑白相間的紙條有機塑料容器內(nèi)。 然后連續(xù)進行 ４ 組訓(xùn)練，每組訓(xùn)練包括：３０ ｓ 的聲音刺激（８０ ｄＢ），間隔 ３０ ｓ。 第 ３ 天實驗為恐懼記憶消散檢測，容器及刺激與第 ２ 天相同。 觀察小鼠的木僵行為。每只小鼠實驗結(jié)束時，用 ７０％乙醇清洗實驗設(shè)備 。
１．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 檢測杏仁核區(qū)組織提取蛋白 取小鼠斷頭，利用振蕩切片機切冠狀面腦片，厚度 ４００ μ ｍ，置入事先通氧飽和的人工腦脊液中孵育 １ ～ １暢 ５ ｈ。 在體視顯微鏡下分離杏仁核裝入 ＥＰ 管，提取蛋白，應(yīng)用ＢＣＡ 法蛋白含量測定。 按 ３０ μ ｇ 蛋白量上樣。
１．５ 杏仁核區(qū)安置套管１０％水合氯醛麻醉小鼠后，用立體定位儀固定頭部。 以前囟為基點，按照杏仁核定位的腦區(qū)坐標(biāo) （ 前囟向后 １.５ ｍｍ，中線旁開 ３.４ｍｍ，向下 ３.５ ｍｍ），將針管按照定位坐標(biāo)的深度插入到需要的腦區(qū)，固定針管并封閉，將其放入籠中休息４ ～ ５ ｄ。
１．６ 高架十字迷宮實驗 在消退訓(xùn)練檢測后 ３ ｈ 將小鼠放在迷宮的中央?yún)^(qū)。記錄 ５ ｍｉｎ 內(nèi)小鼠的運動情況，分析指標(biāo)：進入開放臂時間／ 總的時間。實驗結(jié)束后，用７０％乙醇清洗高架十字迷宮儀器（實驗儀器由上海欣軟信息科技有限公司提供，型號：XR-XG201）。
１．７ 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 ＳＰＳＳ １８.０ 統(tǒng)計軟件，行單因素方差分析（ｏｎｅ －ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。 兩兩比較采用 ＬＳＤ －t檢驗。

３ 討論
焦慮癥的最主要特點之一是恐懼記憶持久存在，難以遺忘。杏仁核是調(diào)節(jié)動物情緒的核心區(qū)域。大量研究表明，杏仁核在焦慮癥的發(fā)生過程中起到?jīng)Q定性的作用。杏仁核參與恐懼記憶的形成、維持和消散。Ｄ－絲氨酸在一些哺乳動物腦區(qū)如海馬、杏仁核等含量豐富。 研究表明，Ｄ－絲氨酸是內(nèi)源性調(diào)節(jié)ＮＭＤＡ 受體重要的共激活分子。它可通過作用于ＮＭＤＡ受體甘氨酸結(jié)合位點增加 ＮＭＤＡ 受體活性，從而影響消退記憶。 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過條件反射性恐懼訓(xùn)練的動物，其行為表現(xiàn)與焦慮癥患者的癥狀相似，是研究焦慮及學(xué)習(xí)記憶經(jīng)典的動物模型，高架十字迷宮是進行焦慮研究的新方法，結(jié)果可靠。通過研究條件性恐懼及消退小鼠杏仁核區(qū) Ｄ－絲氨酸代謝酶的變化，可間接了解杏仁核區(qū)Ｄ－絲氨酸濃度變化。本實驗發(fā)現(xiàn)，消退訓(xùn)練組（第 ２ 天）及消退測試組（第 ３ 天）小鼠杏仁核區(qū) ＳＲ 的表達均下降，ＤＡＡＯ 水平升高，表明恐懼記憶的形成影響杏仁核Ｄ－絲氨酸代謝變化。但條件性恐懼組（第 １ 天）小鼠杏仁核區(qū)ＳＲ 的表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與早期恐懼記憶尚未影響杏仁核區(qū) ＳＲ 的蛋白合成有關(guān)。

恐懼消退受損是焦慮癥狀持續(xù)存在的主要原因，促進恐懼記憶消散是藥物研究的重要靶點。因此，我們研究 Ｄ－絲氨酸抗焦慮作用是否是通過激活 ＮＭＤＡ受體促進恐懼記憶消散來實現(xiàn)的。 通過腹腔注射外源性 Ｄ－絲氨酸或 ＮＭＤＡ 受體阻斷，應(yīng)用恐懼消退測試、高架十字迷宮觀察小鼠恐懼消退或焦慮行為的變化，研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射外源性 Ｄ－絲氨酸鼠木僵行為顯著少于對照組，而腹腔注射 ＭＫ－８０１ 阻斷劑鼠的木僵行為高于對照組。在高架十字迷宮中，Ｄ－絲氨酸組進入開放臂的時間百分比高于對照組，而 ＭＫ－８０１組進入開放臂的時間百分比低于對照組。上述研究結(jié)果表明，Ｄ－絲氨酸可以促進恐懼消退，且其抗焦慮作用是通過激活 ＮＭＤＡ 受體促進恐懼記憶消退來實現(xiàn)的。

近些年的研究顯示杏仁核參與調(diào)控恐懼記憶的形成、鞏固和消散，因此，我們進一步研究 Ｄ－絲氨酸抗焦慮作用是否是通過激活杏仁核區(qū)的 ＮＭＤＡ 受體來實現(xiàn)。通過杏仁核區(qū)立體定位安置套管，微量注射外源性 Ｄ－絲氨酸或者 ＮＭＤＡ 受體阻斷 ＭＫ－８０１，應(yīng)用恐懼消退測試觀察小鼠恐懼消退或焦慮行為的變化。研究發(fā)現(xiàn)杏仁核區(qū)微量注射外源性 Ｄ －絲氨酸組的木僵行為均少于對照組，而 ＮＭＤＡ 受體阻斷劑 ＭＫ－８０１組的木僵行為高于對照組。 表明 Ｄ－絲氨酸抗焦慮作用與激活杏仁核區(qū) ＮＭＤＡ 受體促進恐懼記憶消退有關(guān)。