抗體的概念

 動(dòng)物機(jī)體受到抗原物質(zhì)的刺激后, 由B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞產(chǎn)生的, 能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白, 這類免疫球蛋白稱為抗體(Antibody,簡(jiǎn)稱 Ab)。

免疫球蛋白

免疫球蛋白(Immunogolobulin, 簡(jiǎn)稱Ig)  是指存在于人和動(dòng)物血液(血清)、組織液及其它外分泌液中的一類具有相似結(jié)構(gòu)的球蛋白。

Ig根據(jù)單體數(shù)目、分子量、含糖量、電泳移動(dòng)率等特點(diǎn)分為6類，主要是IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。

Ig由兩個(gè)輕鏈（L）和兩個(gè)重鏈（H）的單體組成，經(jīng)二硫鍵連接呈Y型。Ig的輕鏈?zhǔn)窍嗤�的，有κ（kappa）和λ（Lambda）兩種型別。

五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ

（gamma）鏈和μ（mu）鏈。

IgG的結(jié)構(gòu)見圖。

IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個(gè)區(qū)段，其中兩個(gè)相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段（Fab）。每個(gè)Fab都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，是單價(jià)的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段，無(wú)抗體活性，但具有IgG特有的抗原性。

　　IgG可被胃蛋白酶分解為兩個(gè)片段，一個(gè)Fab雙體，稱F（ab'）2，能和兩個(gè)相同的抗原結(jié)合；另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無(wú)生物活性。

　　IgM是由五個(gè)單體組成的五聚體，含10個(gè)重鏈和10個(gè)輕鏈，具有10個(gè)抗原結(jié)合價(jià)，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個(gè)抗原結(jié)合價(jià)。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。

多克隆抗體(Polyclonal antibody，PAb):

抗原免疫動(dòng)物所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物, 它是由抗原中多種抗原決定簇（即抗原表位）刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的, 稱為多克隆抗體，也稱抗血清。

單克隆抗體(Monoclonal antibody, MAb) :

用雜交瘤技術(shù)獲得能分泌針對(duì)某一種抗原決定簇的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系即單克隆抗體細(xì)胞系，由此單克隆細(xì)胞系產(chǎn)生的大量單一、同質(zhì)的、高純度的針對(duì)單一抗原決定簇的特異性抗體，叫單克隆抗體。（由于每一個(gè)免疫淋巴細(xì)胞只能分泌針對(duì)單一抗原決定簇的特異性抗體）。

動(dòng)物產(chǎn)生抗體的機(jī)理

抗原（非自己的物質(zhì)）免疫動(dòng)物

    →    激活免疫B細(xì)胞

        → 轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞

            →分泌針對(duì)免疫抗原的特異性的抗體

(一)抗原（Antigen, Ag）是指那些能誘導(dǎo)動(dòng)物免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答、產(chǎn)生抗體同時(shí)又能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物在體內(nèi)外特異性結(jié)合、發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。

抗原的反應(yīng)性取決于抗原決定簇（antigenic determinant），或稱為表位（epitope）。一個(gè)抗原分子可帶有不同的決定簇，在免疫測(cè)定中，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì)。能在機(jī)體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。

(二） 抗原的基本特性  

 抗原具有抗原性(antigenicity), 其包括免疫原性與反應(yīng)原性兩方面的含義。

1、免疫原性(immunogenicity)

是指抗原能刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生抗體的特性。

2.反應(yīng)原性(reactinogenicity)

是指抗原與相應(yīng)的抗體發(fā)生反應(yīng)的特性, 此特性又稱為免疫反應(yīng)性(immunoreactivity)。

抗原分為完全抗原及不完全抗原：

① 完全抗原   既具有免疫原性又有反應(yīng)原性的物質(zhì)稱為完全抗原(complete antigen)。如病毒、細(xì)菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于5000Da生物物質(zhì)；

② 不完全抗原  只具有反應(yīng)原性而缺乏免疫原性的物質(zhì)稱為不完全抗原(incomplete antigen), 亦稱為半抗原(hapten)。多糖、藥物、激素、肽類、抗生素、農(nóng)藥等分子量小于5000 Da 物質(zhì)半抗原需與BSA、OVA等載體蛋白交聯(lián)后成會(huì)完全抗原才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的抗體；

半抗原-載體蛋白：

    半抗原單獨(dú)作用機(jī)體的免疫系統(tǒng)時(shí)無(wú)免疫原性，當(dāng)與蛋白 載體（carrier)結(jié)合形成半抗原-載體復(fù)合物時(shí)，即可獲得免疫原性，這種復(fù)合物不但可刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)半抗原的抗體，也可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)蛋白質(zhì)載體的抗體

構(gòu)成抗原的條件：

一、異物性，又稱為異質(zhì)性或異源性

正常情況下，自身組織或細(xì)胞對(duì)機(jī)體本身無(wú)免疫原性。而異種或異體物質(zhì)，以及化學(xué)組成或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的和由于某種因素而暴露的在胚胎期與免疫系統(tǒng)隔絕的自身物質(zhì)則為良好的抗原。

二、理化性狀

大分子物質(zhì)

 抗原的免疫原性與其分子大小有直接關(guān)系：

 1、免疫原性良好的物質(zhì)分子量一般都在10000以上, 在一定條件下, 分子量越大, 免疫原性越強(qiáng)；

 2、分子量小于5000的物質(zhì)免疫原性較弱；

 3、分子量小于1000的物質(zhì)為半抗原, 沒有免疫原性。但與蛋白質(zhì)載體結(jié)合后可獲得免疫原性；

抗原須為大分子物質(zhì)的原因可能是：

 1、抗原分子質(zhì)量越大，表面特殊化學(xué)基團(tuán)（抗原決定簇）就越多，因而就越能有效地刺激免疫細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

 2、大分子抗原物質(zhì)化學(xué)組成復(fù)雜、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被破壞和清除，在體內(nèi)停留時(shí)間較長(zhǎng)，故可持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答。

一般來(lái)講, 分子量越小, 免疫原性越弱, 甚至失去免疫原性。因分子量越小的物質(zhì)越傾向于誘導(dǎo)細(xì)胞免疫而缺乏誘導(dǎo)抗體形成的體液免疫的能力。

人工合成短肽鏈需與大分子載體連接才能激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

三、化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)

 大分子物質(zhì)有時(shí)也并非一定是良好的免疫原，如分子量 99787的明膠，但因其分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象簡(jiǎn)單，為直鏈氨基酸、易降解而使其免疫原性很弱。

一般來(lái)說(shuō),分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象愈復(fù)雜的物質(zhì)免疫原性愈強(qiáng)。如含芳香族氨基酸的蛋白質(zhì)比含非芳香族氨基酸的蛋白質(zhì)免疫原性強(qiáng)。

多糖分子的免疫原性則主要取決于單糖的數(shù)目和類型，并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜者免疫原性強(qiáng)。

如果用理化方法改變抗原的空間構(gòu)象, 其原有的免疫原性也隨之消失。同一分子不同的光學(xué)異構(gòu)體之間也有免疫原性的差異。

 抗原分子并非所有的基團(tuán)都作用一致, 決定其免疫活性的只是其中的一小部分抗原區(qū)域。

抗原決定簇(antigenic determinant)是指存在于抗原分子表面的能夠決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，是與抗體結(jié)合的位點(diǎn)。由于抗原決定簇通常位于抗原分子表面, 因而又稱為表位(epitope) 

 抗原決定簇是具有特殊立體構(gòu)型和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)。

抗原決定簇決定著抗原的特異性, 即決定著抗原與抗體發(fā)生特異結(jié)合的能力。

抗原分子母體表面有不同的抗原決定簇，即具有不同的特異性, 而同一化學(xué)基團(tuán)的不同異構(gòu)體均可影響抗原的特異性。

功能性抗原決定簇和隱蔽的抗原決定簇

1、功能性抗原決定簇：

存在抗原分子表面，能被淋巴細(xì)胞識(shí)別，同時(shí)能與抗體特異性結(jié)合而發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原決定簇，稱為功能性決定簇。

2、隱蔽的抗原決定簇：隱藏在抗原分子內(nèi)部的抗原決定簇

佐劑(Adjuvan)：   先于抗原或與抗原混合后同時(shí)注入動(dòng)物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮輔助作用的一類物質(zhì)。

佐劑作用：

保護(hù)抗原，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的滯留時(shí)間，使抗原緩慢釋放；增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答；增強(qiáng)免疫原性。

最常用的佐劑：

    弗氏佐劑（Freund’s adjuvant）是用礦物油（石臘油）、乳化劑（羊毛脂）和殺死的結(jié)核分枝桿菌(卡介苗)組成的油包水乳化佐劑，這三種成分俱全的佐劑稱為弗氏完全佐劑，不含結(jié)核分枝桿菌的佐劑為弗氏不完全佐劑。

的1、一只兔子每次的免疫劑量：

   細(xì)胞抗原不低于1x107 ；

   可溶性抗原100ug-1mg(300-800ug)；

   合成抗原為2mg（半抗原約為20-200ug）

 2、免疫途徑、免疫次數(shù)和間隔時(shí)間：

    選用皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔或淋巴結(jié)內(nèi)途徑進(jìn)行免疫，一般完全抗原免疫3-4次，合成半抗原免疫6次以上，兩次免疫間隔時(shí)間一般為3周。

【一免】：抗原 300-500ul抗原（濃度為1ug/ul）+300-500ul福氏完全佐劑+適量青霉素和鏈霉素混合，充分乳化，兔子背腹部剪毛后皮下多點(diǎn)注射免疫；（免疫兩只兔子）

  注：抗原完全溶解后搖勻再取樣；福氏完全佐劑需搖勻后吸取免疫前取少量血清，作陰性對(duì)照

【二免】：間隔3周，300ul-500ul抗原+300ul-500ul福氏不完全佐劑+適量青霉素和鏈霉素混合，充分乳化，兔子背腹部剪毛后皮下多點(diǎn)注射免疫；

【三免】：間隔3周，300ul抗原+300ul生理鹽水+適量青霉素和鏈霉素混合，二側(cè)腿部肌注免疫;

【四免】：間隔14天，300ul抗原+300ul生理鹽水+適量青霉素和鏈霉素混合，二側(cè)腿部肌注免疫；

【五免】：間隔14天，300ul抗原+300ul生理鹽水+適量青霉素和鏈霉素混合，二側(cè)腿部肌注免疫；

注：

① 每次免疫后取少量血清，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或間接ELISA測(cè)定效價(jià)，一般瓊脂擴(kuò)散效價(jià)達(dá)1：32或間接ELISA測(cè)定效價(jià)達(dá)1：500000時(shí)可殺兔取血；

② 末免后7-10天取血放與平皿中，置37℃放30分鐘，4 ℃ 放置3-4小時(shí)，待血塊收縮后，吸血清到離心管，5000rpm離心5分鐘，上清即為血清，1.5毫升的離心管分裝-20 ℃ 保存。

淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體

    Köhler和Milstein在1975年建立了體外淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，用人工的方法將產(chǎn)生特異性抗體的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤，這種雜交瘤細(xì)胞既具有骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖的特性, 又具有B細(xì)胞分泌特異性抗體的能力, 由克隆化的B細(xì)胞雜交瘤所產(chǎn)生的抗體即為單克隆抗體

單克隆抗體制備原理

單克隆抗體雜交瘤技術(shù)基本流程

單克隆抗體的制備步驟

1、免疫原的制備；

2、免疫動(dòng)物 ；選擇體重18-20g BALB/C 雌性小鼠用于免疫。50-100ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射及腹腔注射相結(jié)合的方式免疫，總的免疫體積0.2-0.3ml每只；間隔3周，取與一免減半量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3ml每只；過(guò)2-3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合；

3、細(xì)胞融合 ；取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基；用50% PEG（Sigma,分子量1500－4000）作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min；用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞的制備過(guò)程

4、雜交瘤細(xì)胞及陽(yáng)性孔的篩選；細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時(shí)，用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，獲得對(duì)上述抗原有反應(yīng)的陽(yáng)性孔； 

5、陽(yáng)性孔的特異性檢測(cè)及特異性陽(yáng)性孔的克��；陽(yáng)性孔的特異性鑒定采用間接ELISA方法：用包被液稀釋成1-10ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4℃過(guò)夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10％的脫脂奶粉封閉30-60min;加入陽(yáng)性孔培養(yǎng)上清100ul/孔，37℃ 1-2 小時(shí)；PBST洗滌三次后加入按說(shuō)明書稀釋10000倍的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/L H2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD492的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。獲對(duì)抗原有特異性反應(yīng)的陽(yáng)性孔。篩選出的特異性陽(yáng)性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲能分泌抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞株進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存；

6、雜交瘤細(xì)胞和一般細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇方法；雜交瘤細(xì)胞通常用含有8％-10%的二甲亞砜和30％小牛血清的培養(yǎng)基凍存于液氮中，在液氮中細(xì)胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6個(gè)月短期保存。凍存細(xì)胞需要緩慢降溫（4℃冰箱放置15-30分鐘，-20℃冰箱放置30－60分鐘，-80℃超低溫冰箱中放置24小時(shí)），然后放置液氮中長(zhǎng)期保存；也可用細(xì)胞程序凍存盒直接放置-80℃超低溫冰箱。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)需快速升溫，這樣可以確保細(xì)胞有較高的存活率。凍存細(xì)胞管直接放入37℃水中快速升溫復(fù)蘇，離心后去凍存液，沉淀的細(xì)胞用培養(yǎng)基懸浮后細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

7、單克隆抗體腹水制備及純化；取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷，7-10天后腹腔注入5-10×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7-10天后可見小鼠腹部明顯膨大，取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。純化：取1倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸（30ul/ml腹水），室溫下邊加邊攪拌，4℃澄清1小時(shí)，12000rpm離心30min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小時(shí)，5000rpm離心5min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4℃PBS流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的抗體，-70℃保存；

8、單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定；將單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C 小鼠IgA、IgG1、IgG2a、 IgG2b、IgG3、IgM抗體，作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或雙抗夾心ELISA方法鑒定。用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，腹水效價(jià)在10-5-10-7之間的可用于實(shí)際應(yīng)用；

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）（定量、定性實(shí)驗(yàn)）

ELISA是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種免疫測(cè)定技術(shù)，既可以定性也可以定量。主要過(guò)程包括將已知抗原(抗體)吸附在固相載體即聚苯乙烯微量滴定板上稱為包被,然后用封閉液（5% BSA/PBS 溶液）將空余的位點(diǎn)占據(jù)，以避免后續(xù)抗體非特異性吸附。洗滌后加待測(cè)抗體(抗原), 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體，形成已知抗原--待測(cè)抗體--酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算待測(cè)抗體(抗原)的量。

ELISA原理

（1） 抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學(xué)活性；

（2） 抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；

（3） 酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在,而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果；

常用ELISA方法

1、直接法：檢測(cè)抗原

     A:將待檢測(cè)抗原吸附在固相載體表面；

     B:加酶標(biāo)抗體，形成抗原-抗體-酶復(fù)合物；

     C:加底物。底物的降解量＝抗原量。 

2、間接法 ：檢測(cè)抗體（本次ELISA方法）

     A: 將已知抗原吸附于固相載體表面；

     B: 加待檢測(cè)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物；

     C: 加酶標(biāo)二抗；

     D: 加底物。測(cè)定底物降解量=抗體量

3、雙抗體夾心法：檢測(cè)抗原

    A:將抗原免疫第一種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面； 

    B:加待檢抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物；

    C:加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物； 

    D:加酶標(biāo)抗抗體(第二種動(dòng)物抗體的抗體)；  

    E:加底物。底物的降解量＝抗原量。

4 競(jìng)爭(zhēng)法：測(cè)定抗原

 A:將抗體吸附在固相載體表面；  

 B:對(duì)照孔只加入酶標(biāo)抗原；

 C:樣品孔加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體； 

 D:加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

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