一、引言

在許多的細(xì)胞生命活動(dòng)中，例如DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的問(wèn)題。

重組DNA技術(shù)的發(fā)展，人們已分離到了許多重要的基因�，F(xiàn)在的關(guān)鍵問(wèn)題是需要揭示環(huán)境因子及發(fā)育信號(hào)究竟是如何控制基因的轉(zhuǎn)錄活性。為此需要：

a、鑒定分析參與基因表達(dá)調(diào)控的DNA元件；

b、分離并鑒定這些順式元件特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)因子；

這些問(wèn)題的研究都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。

研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法主要包括：

a、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)； 

b、DNase 1 足跡實(shí)驗(yàn)；

c、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)； 

d、體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)； 

e、拉下實(shí)驗(yàn)。

二、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

1 概念

凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gel retardation assay），要叫做DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實(shí)驗(yàn)（Band retardation assay）是在八十年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。

2 原理

  在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的DNA分子向正電極移動(dòng)距離的大小是同其分子量的對(duì)數(shù)成反比。如果某種DNA分子結(jié)合上一種特殊的蛋白質(zhì)，那么由于分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，于是朝正極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)的縮短，因而在凝膠中出現(xiàn)滯后的條帶，這就是凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理。

3  過(guò)程

首先制備細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物（理論上其中含有某種特殊的轉(zhuǎn)錄因子）

用放射性同位素標(biāo)記待檢測(cè)的DNA片段（含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)）

這種被標(biāo)記的探針DNA同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一起進(jìn)行溫育，于是產(chǎn)生DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物

在控制使DNA-蛋白質(zhì)保持結(jié)合狀態(tài)的條件下，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

最后進(jìn)行放射自顯影，分析電泳結(jié)果

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析：

 a、如果有放射性標(biāo)記的條帶都集中于凝膠的底部，這就表明在細(xì)胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)；

b、如果在凝膠的頂部出現(xiàn)放射性標(biāo)記的條帶，這就表明細(xì)胞提取物存在可與探針DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)。

5、DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：

DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)（DNA competitive assay）的具體做法如下：

在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)體系中加入了超量的非標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA（competitor DNA），如果它同探針DNA結(jié)合的是同一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)，那么由于競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)都會(huì)被競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合掉，而使探針DNA仍然處于自由的非結(jié)合狀態(tài)，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會(huì)出現(xiàn)阻滯的條帶；

如果反應(yīng)體系中加入的競(jìng)爭(zhēng)DNA并不能同探針DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一種轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會(huì)出現(xiàn)阻滯的條帶。

6、應(yīng)用：

   a、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)可以用于鑒定在特殊類型細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)）結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)；

   b、DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)同DNA結(jié)合的精確序列部位；

   c、通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)DNA中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的堿基突變可以研究此種突變競(jìng)爭(zhēng)性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合作用的影響；

   d、也可以利用DNA同特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合作用通過(guò)親和層析來(lái)分離特定的轉(zhuǎn)錄因子。

三、足跡實(shí)驗(yàn)

1、定義:

足跡實(shí)驗(yàn)（foot-printing assay），是一種用來(lái)檢測(cè)被特定轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結(jié)構(gòu)的專門實(shí)驗(yàn)方法。

2、原理：

   當(dāng)DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護(hù)而免受DNaseI 酶的切割作用，而不會(huì)產(chǎn)生出相應(yīng)的切割分子，結(jié)果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個(gè)空白區(qū)，俗稱為“足跡”。

3、過(guò)程：

將待檢測(cè)的雙鏈DNA分子在體外用³²P作5‘末端標(biāo)記，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切出其中的一個(gè)末端，于是便得到了一條單鏈末端標(biāo)記的雙鏈DNA 

在體外同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物（細(xì)胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體 

在反應(yīng)混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之達(dá)到平均每條DNA鏈，只發(fā)生一次磷酸二酯鍵的斷裂：

a、如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特定蛋白質(zhì)，使DNase I消化之后，便會(huì)產(chǎn)生出距離放射性標(biāo)記末端1個(gè)核苷酸，2個(gè)核苷酸，3個(gè)核苷酸------等等一系列前后長(zhǎng)度均相差一個(gè)核苷酸的不間斷的連續(xù)的DNA片段梯度群體；

b、如果DNA分子同蛋白質(zhì)提取物中的某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，被結(jié)合部位的DNA就可以得到保護(hù)免受DNase I酶的降解作用除去蛋白，加樣在20%序列膠上進(jìn)行電泳分離，實(shí)驗(yàn)分兩組:

a、實(shí)驗(yàn)組：DNA+蛋白質(zhì)混合物

b、對(duì)照組：只有DNA，未與蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行溫育

最后進(jìn)行放射性自顯影，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4、結(jié)果判斷:

實(shí)驗(yàn)組凝膠電泳顯示的序列，出現(xiàn)空白的區(qū)域表明是轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合部；與對(duì)照組序列比較，便可以得出蛋白質(zhì)結(jié)合部位的DNA區(qū)段相應(yīng)的核苷酸序列。

5、其他的足跡實(shí)驗(yàn)方法：

除了DNase1足跡試驗(yàn)之外，目前還發(fā)展出了若干種其他類型的足跡實(shí)驗(yàn)，例如：

a、 自由羥基足跡實(shí)驗(yàn)；b、菲咯啉銅足跡實(shí)驗(yàn)；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實(shí)驗(yàn)

DMS(硫酸二甲酯)足跡實(shí)驗(yàn)的原理

DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會(huì)對(duì)甲基化的G殘基作特異性的化學(xué)切割。如果DNA分子中某一區(qū)段同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，就可以避免發(fā)生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用。

四、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)

1、概念：

甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（Methylation interference assay）是根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會(huì)對(duì)甲基化的G殘基作特異性的化學(xué)切割這一原理設(shè)計(jì)的另一種研究蛋白質(zhì)同DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)方法。

應(yīng)用這種技術(shù)可以檢測(cè)靶DNA中G殘基的優(yōu)先甲基化，對(duì)爾后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)的揭示出DNA與蛋白質(zhì)相互作用的模式。

2、實(shí)驗(yàn)步驟：

 用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發(fā)生一個(gè)G堿基甲基化作用）

 同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一起進(jìn)行溫育，促進(jìn)使DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合

進(jìn)行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶：

a、 其一沒有同蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA正常電泳條帶

b、其二同特異蛋白質(zhì)結(jié)合而呈現(xiàn)滯后的DNA電泳條帶

將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出，并用六氫吡啶進(jìn)行切割，結(jié)果為：

 a、甲基化的G殘基被切割:因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)只能夠同未發(fā)生甲基化的正常的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，所以在轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)序列中的G殘基如果被DMS甲基化之后，轉(zhuǎn)錄因子就無(wú)法同其結(jié)合位點(diǎn)（順式元件）發(fā)生結(jié)合作用，從而使得結(jié)合位點(diǎn)中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割；

 b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會(huì)被切割

將結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶和不結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶，經(jīng)六氫吡啶切割作用之后，再進(jìn)行凝膠電泳

作放射自顯影，讀片并分析結(jié)果

3、結(jié)果判斷：

   a、同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的靶DNA序列，經(jīng)六氫吡啶切割之后，電泳分離呈現(xiàn)兩條帶，有一個(gè)空白區(qū)

   b、不同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的靶DNA序列，經(jīng)六氫吡啶切割后，電泳分離呈現(xiàn)三條帶，沒有空白區(qū)域的出現(xiàn)。

4、應(yīng)用：

   a、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合位點(diǎn)中的G殘基之間的聯(lián)系；

   b、是足跡實(shí)驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡實(shí)驗(yàn)中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置

5、缺點(diǎn)：

   DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化，而不能使T和C殘基甲基化。

五、體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)

上面討論的三種研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用的方法，有一個(gè)共同的不足之處在于它們是在體外進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，因此人們就會(huì)考慮這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否能夠反映細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的真實(shí)生命過(guò)程，即細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的真實(shí)的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用情況。

為了解答這個(gè)問(wèn)題，科學(xué)家就設(shè)計(jì)出了一種體內(nèi)足跡試驗(yàn)（in vivo foot-printing assay），該方法可以看做是體外DMS足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)變種。1、原理：

體內(nèi)足跡試驗(yàn)的原理原則上同體外DMS足跡實(shí)驗(yàn)無(wú)本質(zhì)差別，即

a、DMS能夠使G殘基甲基化；

b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基；

c、同特異轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的識(shí)別序列中的G殘基由于受到蛋白質(zhì)的保護(hù)而不會(huì)被DMS甲基化，于是不會(huì)被六氫吡啶切割；

d、同對(duì)照的裸露的DNA形成的序列梯作比較，就會(huì)發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應(yīng)條帶。

2、過(guò)程：

用有限數(shù)量的化學(xué)試劑DMS處理完整的游離細(xì)胞，使?jié)B透到胞內(nèi)的DMS濃度恰好導(dǎo)致天然染色體DNA的G殘基發(fā)生甲基化

對(duì)這些經(jīng)過(guò)DMS處理的細(xì)胞提取DNA，并在體外加入六氫吡啶作消化反應(yīng)

PCR擴(kuò)增后作凝膠電泳分析，因?yàn)樵隗w外實(shí)驗(yàn)中用的是克隆的DNA片段其數(shù)量足夠，而在體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA，其數(shù)量是微不足道的，所以需要經(jīng)PCR擴(kuò)增以獲得足夠數(shù)量的特異DNA

放射自顯影，讀片并記錄讀片的結(jié)果

3、結(jié)果判斷：

   a、能夠同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)段其中G殘基受到保護(hù)因而不會(huì)被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用；

   b、體外裸露的DNA分子上，G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割。

六、拉下實(shí)驗(yàn)（Pull-down assay）

拉下實(shí)驗(yàn)又叫做蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)（binding assay in vitro），是一種在試管中檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標(biāo)簽以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組，表達(dá)為融合蛋白。分離純化融合蛋白并與磁珠結(jié)合，使之固相化之后，再與表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞提取物混合保溫適當(dāng)時(shí)間，例如在4℃下保溫過(guò)夜，使目標(biāo)蛋白同已經(jīng)固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結(jié)合。離心收集與固定化的融合蛋白（即與磁珠相互結(jié)合的融合蛋白）中的誘餌蛋白相結(jié)合的目的蛋白，經(jīng)過(guò)煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物（例如磁珠）上脫離下來(lái)，收集樣品，再與目標(biāo)蛋白的抗體作Western blotting分析，以檢測(cè)出與誘餌蛋白的目標(biāo)的目標(biāo)蛋白。