人類基因組計劃、基因芯片、個性化分子診斷、生物云計算……這些在21世紀(jì)第一個十年里吸引無數(shù)眼球的熱門詞匯，都和一個產(chǎn)業(yè)頗有淵源——DNA測序。生物技術(shù)和信息技術(shù)在這片創(chuàng)意新天地里水乳交融，如果用一句詩來形容坐擁兩大技術(shù)護航的DNA測序產(chǎn)業(yè)，那就是——天生麗質(zhì)難自棄。

隨著人類基因組計劃的完成，人類對自身遺傳信息的了解和掌握有了前所未有的進步。與此同時，分子水平的基因檢測技術(shù)平臺不斷發(fā)展和完善，使得基因檢測技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，基因檢測效率不斷提高。從最初第一代以 Sanger 測序為代表的直接檢測技術(shù)和以連鎖分析為代表的間接測序技術(shù)，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技術(shù)和 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的新一代測 序 (next-generation sequencing，NGS) 的 相 繼 出現(xiàn)，測序效率明顯提升，時間明顯縮短，費用明顯降低，基因檢測手段有了革命性的變化。

DNA測序技術(shù)經(jīng)歷了不同的發(fā)展階段，本文將重點介紹第一代、第二代、第三代測序的基本原理、代表性的測序平臺以及不同發(fā)展階段的測序技術(shù)的特點。

第一代測序技術(shù)

傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNA測序技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術(shù)。人類基因組計劃(human genome project，HGP)主要基于第一代DNA測序技術(shù)。

雙脫氧鏈終止法

雙脫氧鏈終止法又稱為Sanger法。該方法的原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種單脫氧核苷三磷酸(dNTP，其中的一種用放射性P32標(biāo)記)存在條件下復(fù)制時，在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，因為雙脫氧核苷沒有3’OH，所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端，該鏈就停止延長，若鏈端摻入單脫氧核苷，鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分4個泳道進行凝膠電泳，分離長短不一的核酸片段，長度相鄰的片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后，根據(jù)片段3’端的雙脫氧核苷酸，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。

第一代測序技術(shù)的主要特點是：

• 測序讀長可達1000bp；
• 準(zhǔn)確性高達99.999%；
• 測序成本高；
• 通量低。

第二代測序技術(shù)（NGS）

隨著人類基因組計劃的完成，人們進入了后基因組時代，即功能基因組時代，傳統(tǒng)的測序方法已經(jīng)不能滿足深度測序和重復(fù)測序等大規(guī)�；�因組測序的需求，這促使了新一代DNA測序技術(shù)的誕生。新一代測序技術(shù)也稱為第二代測序技術(shù)，主要包括羅氏454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLID測序平臺。

第二代測序技術(shù)核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列。以Illumina的技術(shù)原理為例做一下說明：先在片段DNA兩端臉上接頭，目的是能夠匹配到芯片上的接頭，接著與芯片雜交，進行橋式擴增，接著簇的形成，是為了保證信號強度，再加入四種有阻滯劑和熒光標(biāo)記的單核苷酸，如此循環(huán)，記錄每個循環(huán)的熒光信息，最后得到序列信息。

第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行，同時成本也大大下降。

Illumina測序流程

第三代測序技術(shù)

近年來，測序技術(shù)取得了新的進展，發(fā)展到第三代測序。第三代測序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標(biāo)的邊合成邊測序。該技術(shù)不需要經(jīng)過PCR擴增，實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序。代表性的測序平臺有PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術(shù)。

其中PacBio SMRT技術(shù)其實也應(yīng)用了邊合成邊測序的思想，并以SMRT芯片為測序載體。基本原理是： DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP），在堿基配對階段，不同堿基的加入，會發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。同時這個 DNA 聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一。SMRT技術(shù)的測序速度很快，每秒約10個dNTP。

三代測序設(shè)備在DNA 序列片段讀長上優(yōu)于二代設(shè)備，但在準(zhǔn)確度上較二代設(shè)備差，未來隨著技術(shù)的改善，三代測序設(shè)備將更為穩(wěn)定和成熟。

PacBio SMRT測序原理

DNA測序技術(shù)經(jīng)過30多年的發(fā)展，目前已經(jīng)到了第三代，三代測序技術(shù)有各自的優(yōu)勢。未來，基于不同的測序的目的，三代測序技術(shù)的應(yīng)用將各自發(fā)揮功效，同時測序成本也將進一步下降，測序技術(shù)的快速發(fā)展也將促進生物研究和醫(yī)療應(yīng)用的進步。