摘 要 目的 研究 miＲ － 16 在慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁癥模型大鼠神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的表達(dá)及其與 5 － 羥色胺( 5 －HT) 轉(zhuǎn)運(yùn)體的關(guān)聯(lián)性。方法 對(duì)照組和慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型組大鼠各 10 只，模型組大鼠接受 21 天的不可預(yù)知溫和應(yīng)激刺激，對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)。兩組大鼠麻醉后收集腦脊液，測定 miＲ － 16。然后斷頭處死，分離前額葉皮質(zhì)、中縫核、海馬，測定 miＲ － 16 和 5 － HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白。結(jié)果 模型組大鼠腦脊液和中縫核的 miＲ － 16 相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，中縫核 miＲ － 16與 5 － HT 胺轉(zhuǎn)運(yùn)體呈負(fù)相關(guān); 而前額葉皮質(zhì)和海馬中的 miＲ － 16、5 － HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體分別與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0. 05) 。結(jié)論 中縫核 miＲ － 16 可能通過調(diào)節(jié) 5 － HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，參與抑郁癥的病理過程，腦脊液 miＲ － 16 亦可能與抑郁癥相關(guān)。

關(guān)鍵詞 慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型;miＲ － 16;5 － HT;轉(zhuǎn)運(yùn)體

世界衛(wèi)生組織公布，抑郁癥已成為世界第 4 大疾患，預(yù)計(jì)到 2020 年，可能成為僅次于冠心病的第 2 大疾病。抑郁癥具有患病率高( 終生患病率女性為10% ～ 25% 、男性為 5% ～ 12% ) 、復(fù)發(fā)率高 ( 1 年30% ，5 年 70% ) 、自殺率高( 10% ～ 25% ) 等特點(diǎn)，是全球性公共衛(wèi)生問題之一，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來極大的精神損失和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未清楚，給該病的診斷和治療帶來極大困難。microＲNAs( miＲNAs) 是近年來表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)，是一類進(jìn)化保守的、18 ～ 25 個(gè)核苷酸的非編碼 ＲNA 分子，通過與靶基因的 mＲNA 3'非翻譯區(qū)( 3' － untranslated region，UTＲ) 結(jié)合，引起 mＲNA的降解或者翻譯的抑制，從而調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，在生物發(fā)育和疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用�，F(xiàn)有的研究揭示，miＲ － 16 可能與抑郁癥相關(guān)，其參與抑郁癥的機(jī)制，可能是其在腦組織中以 5 － 羥色胺( 5 － HT)轉(zhuǎn)運(yùn)體( serotonin transporter，SEＲT) 基因作為靶基因，參與 SEＲT 翻譯水平的調(diào)控，從而影響腦組織內(nèi)5 － HT 神經(jīng)遞質(zhì)功能發(fā)揮。但至今尚未明確神經(jīng)系統(tǒng)中的哪些部位參與抑郁癥的發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型，比較抑郁模型組和對(duì)照組 miＲ － 16 在不同部位( 腦脊液、前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核) 的差異，以及分析 miＲ － 16與 SEＲT 蛋白的相關(guān)性，旨在探明 miＲ － 16 參與抑郁癥的作用部位及其機(jī)制，為弄清抑郁癥的發(fā)病機(jī)制以及尋找合適的生物學(xué)標(biāo)志物提供參考。

材料與方法

1． 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組: 清潔級(jí)雌性 SD 大鼠 20 只，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào): SCXK( 浙) 2008 － 0033，體重約 150g，隨機(jī)分成對(duì)照組( 10 只) 和抑郁模型組( 10 只) 。飼養(yǎng)室溫度 23 ± 1℃ ，相對(duì)濕度 55% ± 5% 。

2． 抑郁模型建立: 慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激( chronic unpre-dictable mild stress，CUMS) 模型組大鼠每天隨機(jī)接受以下刺激中 的 1 種: 4℃ 冰 水 浴5min、禁 水 24h、晝 夜 跌 倒、懸 尾10min、45℃ 高溫 5min、禁食 48h、鼠籠傾斜 24h、潮濕墊料 24h、夾尾 1min、束縛應(yīng)激 2h，連續(xù) 3 周。對(duì)照組大鼠每天 12h 明亮( 8: 00 ～ 20: 00) 、12h 黑暗( 20: 00 ～ 8: 00) ，自由攝食飲水。

3． 抑郁行為評(píng)定: 采用糖水消耗實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)評(píng)定抑郁樣行為。

(1) 糖水消耗實(shí)驗(yàn): 造模前和造模后各 1 次，分 3天完成，第 1 天將大鼠單籠飼養(yǎng)，給予 2 瓶 1% 的蔗糖水; 第 2天，將其中 1 瓶蔗糖水換成自來水，進(jìn)行蔗糖水偏好訓(xùn)練。第3 天，大鼠禁水 23h 后，給予 1 瓶 1% 蔗糖水和 1 瓶自來水，計(jì)算 1h 內(nèi)蔗糖水和自來水消耗量，進(jìn)行糖水偏好率測定。糖水偏好率( % ) = 糖水消耗量/( 糖水消耗量 + 自來水消耗量) ×100% 。

(2) 曠場實(shí)驗(yàn): 長寬高分別 100cm、100cm 和 40cm 的容器（上海欣軟提供），底部等分為面積相等的 25 格，內(nèi)壁為黑色，容器正上方放置一個(gè)攝像頭，將單只大鼠放入中央，紀(jì)錄 3min 內(nèi)的行走得分與垂直得分( 行走得分: 大鼠 3 只爪子進(jìn)入 1 個(gè)格子計(jì) 1分; 垂直得分: 大鼠前爪離地或攀附桶壁 1 次計(jì) 1 分) 。曠場試驗(yàn)固定在 18: 00 ～ 19: 00 時(shí)進(jìn)行，安靜黑暗環(huán)境，并每次都清理大鼠排泄物，去除可能留下的味道。每只大鼠造模前與造模后共進(jìn)行 2 次曠場試驗(yàn)。

4． 腦脊液、前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核組織的取材: 抑郁行為學(xué)指標(biāo)測定后，在大鼠麻醉后，頭部固定于定向儀上。頭頸部剪毛、消毒，用手術(shù)刀沿縱軸切一縱行切口( 約 2cm) 用剪刀鈍性分離頸部背側(cè)肌肉。為避免出血，最深層附著在骨上的肌肉用手術(shù)刀背刮開，暴露出枕骨大孔，由枕骨大孔進(jìn)針直接抽取腦脊液。斷頭處死大鼠，按包新民等的大鼠腦立體定位圖譜，在冰上迅速分離前額葉皮質(zhì)、海馬和中縫核。

5． Western blot 法測定 SEＲT 蛋白: 使用真核膜蛋白提取試劑盒 Mem － PEＲ Eukaryotic Membrane Protein Extraction Ｒea-gent Kit( Thermo Fisher Scientific 公司，美國) 提取前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核組織的膜蛋白，并且通過 Bradford 法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。Western blot 法測定 SEＲT 蛋白的步驟按照 Huff等的文章進(jìn)行。抗 SEＲT 一抗 ( 1∶ 250 稀釋) ，抗 β － actin一抗( 1∶ 250 稀釋) 以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗( 1∶ 5000稀釋) 購自加拿大 Santa Cruz 公司。使用 Chemi Doc TM XＲS +( Bio － rad 美國) 系統(tǒng)自帶的軟件分析 SEＲT 蛋白條帶，并用β － actin 進(jìn)行校正。

6． 實(shí)時(shí) 熒 光 定 量 PCＲ 法 測 定 miＲ － 16: 通 過 miＲcutemiＲNA

提取分離試劑盒 ( 北京天根生化科技有限公司) 提取腦脊液、前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核總 ＲNA，用 nanodrop( 美國thermo scientific 公司) 測定其濃度及純度; 取 2μg ＲNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的 c DNA 用于下一步的實(shí)時(shí)定量熒光 PCＲ 擴(kuò)增。U6 為 內(nèi) 參 校 準(zhǔn) 基 因，引 物 序 列: 5' － ACGCAAATTCGT-GAAGCGTTCCAT － 3'，miＲ － 16 引 物 序 列: 5' － TAGCAG-CACGTAAATTGGCG － 3'。下游引物為通用引物［北京天根生化科技有限公司 miＲcute miＲNA 熒光定量檢測試劑盒( SYBＲGreen) 自帶］。實(shí)時(shí)定量熒光 PCＲ 擴(kuò)增程序?yàn)? 預(yù)變性 94℃2min; PCＲ 反應(yīng): 94℃ 20s，60℃ 34s

，循環(huán) 40 次，實(shí)時(shí) PCＲ 儀購自 ABI 公司 stepone plus，使用儀器配套軟件自動(dòng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到每個(gè)樣本的循環(huán)閾值( cycle threshold，Ct 值) ，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得每個(gè)樣本的 miＲ － 16 含量，所得數(shù)據(jù)用對(duì)應(yīng)的 U6 進(jìn)行校正。

7． 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法: 采用 SPSS 19． 0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用 Pearson 相關(guān)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x ± s) 表示。以 P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過建立慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激大鼠抑郁模型，研究大鼠神經(jīng)系統(tǒng)不同部位 miＲ － 16 表達(dá)及其與 SEＲT 的關(guān)聯(lián)性，從而進(jìn)一步明確 miＲ － 16 在何部位參與抑郁癥的病理生理過程。在脊椎動(dòng)物體內(nèi)，腦組織中的 miＲNAs 遠(yuǎn)比其他組織豐富，提示miＲNAs 可能在腦功能的發(fā)揮中起著重要作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，腦脊液中的 miＲNAs 可能與精神疾病相關(guān)。比如 2014 年，Muller 等的研究表明，阿爾茨海默病患者腦脊液中的 miＲ － 146a 比健康人低。但是迄今為止，尚未有抑郁癥腦脊液 miＲ － 16 水平的報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采集了抑郁模型大鼠的腦脊液，進(jìn)行 miＲ － 16 測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其水平比對(duì)照組大鼠低。該結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)，以確定腦脊液 miＲ － 16作為抑郁癥生物學(xué)標(biāo)志物的可行性。

本研究還對(duì)腦組織前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核中的 miＲ － 16 進(jìn)行了測定。有研究者發(fā)現(xiàn)，抑郁癥自殺患者前額葉皮質(zhì)中的某些 miＲNAs 存在異常，如miＲ － 494 和 miＲ － 335 比健康對(duì)照低。但是，目前尚未發(fā)現(xiàn)抑郁癥前額葉皮質(zhì) miＲ － 16 的報(bào)道，本次抑郁模型大鼠的前額葉皮質(zhì) miＲ － 16 水平測定結(jié)果表明，模型組大鼠前額葉皮質(zhì) miＲ － 16 水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且該部位 SEＲT 蛋白的表達(dá)亦與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明，前額葉皮質(zhì) miＲ － 16 可能不參與抑郁癥的病理過程。

近年來，海馬 miＲ － 16 與抑郁癥的研究得到了一些研究者的關(guān)注。如張逸等在母愛剝奪大鼠抑郁模型中，發(fā)現(xiàn)海馬 miＲ － 16 比正常大鼠高，作者認(rèn)為，海馬高 miＲ － 16 參與了母愛剝奪誘發(fā)的大鼠抑郁樣行為的病理過程。在另外的一項(xiàng)研究中，抗抑郁藥氟西汀能降低小鼠海馬組織 miＲ － 16，如果使用人工合成的抗 miＲ － 16 對(duì) miＲ － 16 進(jìn)行中和，則抗miＲ － 16 表現(xiàn)出抗抑郁樣作用。但是在 Bai 等的研究中，作者采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激建立抑郁模型，未發(fā)現(xiàn)模型大鼠的海馬 miＲ － 16 發(fā)生改變�；�于海馬 miＲ － 16 在不同抑郁模型結(jié)果中的不一致性，以及 Bai 等未比較海馬 SEＲT 蛋白的差異，因此本實(shí)驗(yàn)在測定模型大鼠海馬 miＲ － 16 的同時(shí)，也分析了海馬 SEＲT 的差異，結(jié)果表明，模型大鼠海馬miＲ － 16 并未升高，該結(jié)論與 Bai 等發(fā)表的論文一致，而且該部位 SEＲT 蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組比較，亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明，海馬 miＲ － 16 未參與和慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁相關(guān)的病理過程，提示不同的應(yīng)激所誘發(fā)的大鼠抑郁行為，其機(jī)制可能不同。

中縫核因聚集 5 － HT 能神經(jīng)元，其主要功能是產(chǎn)生遞質(zhì) 5 － HT，因而在 miＲ － 16 與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性研究 中 具 有 重 要 意 義。 Baudry 等 將 氟 西 汀( 1μmol/L、2μl/min) 直接緩慢注入中縫核 3 天，發(fā)現(xiàn)該區(qū)miＲ － 16 升高了 2． 5 倍，SEＲT 的表達(dá)降低了 2倍; 直接在該區(qū)注射 miＲ － 16( 1μl、2μmol/L) 也觀察到 SEＲT 表達(dá)的下降; 然而，當(dāng)氟西汀和抗

miＲ － 16一起注射的時(shí)候，SEＲT 表達(dá)未受影響，由此可見，氟西汀是通過

miＲ － 16 調(diào)節(jié) SEＲT 蛋白的表達(dá)。然而，在抑郁動(dòng)物模型中，中縫核 miＲ － 16 與對(duì)照的差異卻未被報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)表明，慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型大鼠中縫核 miＲ － 16 低于對(duì)照組，其SEＲT 蛋白水平卻高于對(duì)照組，且兩者間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。筆者認(rèn)為，中縫核低 miＲ －16 狀態(tài)，可導(dǎo)致 SEＲT 蛋白過高表達(dá)，從而影響 5 － HT 遞質(zhì)系統(tǒng)的功能，從而參與慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激造成的抑郁過程。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過測定神經(jīng)系統(tǒng)不同部位 miＲ －16 水平，探討 miＲ － 16

參與抑郁癥的可能部位及其機(jī)制。結(jié)果表明，慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型大鼠腦脊液和中縫核 miＲ － 16 存在異常，中縫核 miＲ －16 可能通過調(diào)節(jié) SEＲT 蛋白表達(dá)而參與抑郁癥的發(fā)病過程。