基于脾氣虛的脾陽虛大鼠模型的復(fù)制方法及評價標準研究

【摘要】　目的：研究階段式大鼠脾陽虛證模型的復(fù)制方法及客觀評價標準。方法：32 只 SPF 級雄性SD 大鼠隨機分為對照組和脾陽虛證模型組（模型組），每組 16 只。模型組大鼠采用兩段式造模方法；第1 階段，即前 15 d 施加飲食不節(jié)和力竭游泳刺激；第 2 階段，即后 7 d 每日早晚 2 次灌服番瀉葉。為質(zhì)控造模過程，以臨床辨證要點為基礎(chǔ)，建立了大鼠脾氣虛和脾陽虛證的評價標準，并進行客觀評價。結(jié)果：與對照組比較，模型組大鼠在第 1 階段出現(xiàn)了消瘦、食少、神疲和乏力等癥狀，表明大鼠處于脾氣虛狀態(tài)；在第 2 階段，上述變化更加嚴重，且有畏寒、便溏等癥狀，提示大鼠處于脾陽虛狀態(tài)。結(jié)論：本研究中采用的兩段式造模方法和模型評價標準，能夠成功復(fù)制大鼠脾陽虛證模型。

【關(guān)鍵詞】　脾陽虛；　脾氣虛；　動物模型；　大鼠；　評價標準

脾陽虛證是中醫(yī)證候研究的重要內(nèi)容，其大鼠模型的復(fù)制方法有單因素法和復(fù)合因素法，因后者更好地模擬了該證的病因病機，目前應(yīng)用較多，但還存在一些急需解決的問題。首先是模型的局限性問題。因為脾陽虛證的病因病機復(fù)雜，難以全面模擬，所以現(xiàn)有模型實為有限模型，并不具備脾陽氣證的全部內(nèi)涵，必須加以限定。其次是模型復(fù)制的質(zhì)控問題。復(fù)合因素造模法多為兩段式，即先復(fù)制脾氣虛，再復(fù)制脾陽虛，而模型評價僅涉及脾陽虛，缺乏過程管理。為解決上述問題，本研究先后模擬脾氣虛證和脾陽虛證的主要病因病機，并建立了階段性評價標準以質(zhì)控，成功復(fù)制了脾陽虛證的有限模型，特報道如下。

1　材料與方法

1.1　實驗動物與分組　32 只 SPF 級雄性 SD 大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，購于遼寧省本溪市實驗動物中心 [SCXK（遼）-2010-0001]，隨機分為對照組和脾陽虛證模型組（模型組），每組 16 只。大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心 [SYXK（遼）-2013-000-9]，室溫 18~23 ℃，相對濕度 45%~55%，自由飲水進食，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，開始實驗。

1.2　模型復(fù)制方法　第 1 階段（phase 1， P1），按文獻 [12] 方法復(fù)制脾氣虛證模型（飲食失節(jié)＋勞倦型），即模型組大鼠在 15 d 內(nèi)：（1）先飽食 1 d，再禁食 2 d，均不禁水，共 5 個循環(huán)；（2）每日水溫35~37 ℃游泳至力竭。第 2 階段（phase 2， P2），復(fù)制脾陽虛證模型（苦寒瀉下型），即每日灌服 20% 番瀉葉水浸劑（2 m L/100 g），早晚各 1 次，連續(xù) 7 d。

1.3　模型評價標準　以大鼠的生物學(xué)特征為基礎(chǔ)，根據(jù)臨床辨證要點，擬定脾氣虛證的評價標準：消瘦，食少，神疲，乏力；脾陽虛證模型評價標準：前述標準加畏寒、便溏。

1.4　模型評價方法　分別在 P1、P2，每組取 8 只大鼠進行評價。

1.4.1　代謝水平評價　上午 9~10 時測量其體質(zhì)量以評價消瘦；測肛溫以評估畏寒；單只放入代謝籠24 h 后計算進食 / 水量，即投食 / 水量 - 剩余量，以評價食少；按文獻 [12] 方法收集糞便，檢測大便含水率，即（大便濕重 - 大便干重）/ 大便濕重×100%，觀察便溏情況。

1.4.2　神疲評價　采用Supermaze動物行為學(xué)實驗系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），按文獻 方法進行檢測，即將大鼠放入箱體中心，觀察 5 min 內(nèi)大鼠的運動距離和站立次數(shù)，徹底清潔箱體后，檢測下一只大鼠。

1.4.3　乏力評價　采用 YLS-13A 大小鼠抓力測定儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）檢測前肢抓力。先用右手將大鼠按放在抓力板上，左手向前推抓力板，然后右手向后滑至鼠尾部，左手輕輕松開抓力板，待大鼠用力抓住抓力板時，及時加力后拉，以得到最大抓力。專人連續(xù)測量 3 次，取平均值。

1.5　統(tǒng)計學(xué)處理　采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以（x-±s）表示，比較采用單因素方差分析，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1  大鼠代謝水平  由表 1 可見，與對照組 P1 比較，模型組 P1 大鼠的體質(zhì)量、進食量和進水量均下降，該組大鼠出現(xiàn)消瘦和食少；與對照組 P2 比較，模型組 P2 的體質(zhì)量、肛溫、進食量和進水量均減少，該組大鼠出現(xiàn)了消瘦、畏寒和食少，而大便含水率增加，該組大鼠出現(xiàn)便溏；與模型組 P1 比較，模型組 P2 的體質(zhì)量和肛溫均下降，但大便含水率升高。

2.2  大鼠神疲乏力情況  圖 1 和表 2 可見，對照組P1 和 P2 比較無明顯差異，大鼠活動區(qū)域大，運動距離遠，站立次數(shù)多，前肢抓力大；與對照組 P1比較，模型組 P1 和 P2 的活動區(qū)域明顯變小，運動距離、站立次數(shù)和前肢抓力均明顯下降，提示兩組大鼠出現(xiàn)了神疲和乏力現(xiàn)象；與模型組 P1 比較，模型組 P2 的活動區(qū)域更小，甚至沒有形成閉合運動軌跡，上述 3 個指標均降低，表示該組大鼠的神疲和乏力更加嚴重。

3　討論

動物模型是中醫(yī)證候研究的重要內(nèi)容，其復(fù)制過程應(yīng)符合中醫(yī)理論，不能單純進行癥狀模擬，還應(yīng)考慮病因，甚至是模擬相關(guān)病機。通常認為，脾陽虛的發(fā)生多源于脾氣虛，也可因外寒直中、苦寒傷陽和腎陽不足。由于病因較多，本研究僅選擇了脾氣虛和苦寒傷陽兩個進行模擬，即以脾氣虛大鼠為對象，通過灌服番瀉葉，達到損傷脾陽的目的。而在復(fù)制脾氣虛模型時，首先考慮的仍然是病因病機。誘發(fā)脾氣虛的病因有飲食不節(jié)，勞倦過度，憂思日久，稟賦不足，素體虛弱，年老體衰，大病初愈，調(diào)養(yǎng)失慎等。還是由于病因較多，本研究選擇了較為常見的飲食不節(jié)和勞倦過度進行模擬，即采用飽食 1 d，饑餓 2 d，結(jié)合每日力竭游泳，造成脾氣虛。因此，本實驗在復(fù)制脾陽虛模型的過程中，先后施加的因素有飲食失節(jié)、勞倦過度和苦寒傷陽，分別模擬了脾氣虛和脾陽虛證的部分病因病機，同時也限定了本實驗所復(fù)制的脾氣虛為飲食不節(jié)和疲勞型，脾陽虛為脾氣虛和苦寒傷陽型。

由于模型復(fù)制為階段性，其評價也應(yīng)分階段進行，從而有效質(zhì)控模型復(fù)制過程。本研究依據(jù)二證的臨床辨證要點，結(jié)合大鼠的生物學(xué)特征，建立了較為簡便易行的模型評價標準。首先根據(jù)脾氣虛的臨床辨證要點，即食少、腹脹、便溏及氣虛證等，建立大鼠脾氣虛的評價標準為：消瘦，食少，神疲，乏力；其次根據(jù)脾陽虛的臨床辨證要點，即脾氣虛的癥狀加虛寒證，設(shè)立大鼠脾陽虛證的模型評價標準為：消瘦，食少，神疲，乏力，畏寒，便溏。實際上，后一評價標準為前一標準加上畏寒和便溏，即脾氣虛加寒象，這體現(xiàn)了模型評價的連續(xù)性。依此標準，本研究在造模的 P1 和 P2 進行階段性評價。探索客觀簡便的模型評價方法一直是中醫(yī)證候模型研究的重要內(nèi)容，其目的是減少主觀因素對實驗的干擾，提高模型復(fù)制的成功率，確保模型復(fù)制的穩(wěn)定性，從而保證實驗結(jié)果的可重復(fù)性。針對上述評價標準，本實驗建立了較為客觀和簡便的檢測方法，以評估大鼠的類人癥狀。實際上，目前已經(jīng)能夠通過檢測大鼠的體質(zhì)量、肛溫、進食 / 水量和大便含水率等，分別對消瘦、畏寒、食少和便溏等進行量化評價。本實驗結(jié)果顯示，模型組 P1 的體質(zhì)量、進食 / 水量均低于對照組 P1，但肛溫和大便含水率無明顯變化，表明大鼠在接受 15 d 的飲食不節(jié)和力竭游泳刺激后，出現(xiàn)了消瘦和食少，但無畏寒和便溏現(xiàn)象；模型組 P2 的體質(zhì)量、進食 / 水量、肛溫均

低于對照組 P2，且大便含水率顯著增加，說明該組大鼠出現(xiàn)了消瘦、食少、畏寒和便溏等類人癥狀。

與上述指標不同，“神疲”和“乏力”屬于自述性疲勞癥狀，僅憑目測難以客觀判定大鼠的疲勞程度，特別是難以區(qū)分二者在脾氣虛和脾陽虛中的差別。本課題組前期工作提出，“神疲”和“乏力”均屬于疲勞范疇，但前者主要是中樞性，后者則為外周性，可以分別采用曠場實驗和檢測大鼠雙前肢抓力進行客觀評價。本實驗觀察到，對照組 P1和 P2 大鼠進入檢測箱后，更多地活動于四周較暗區(qū)域，并有快速通過中心強光區(qū)域的現(xiàn)象，其運動距離遠、站立次數(shù)多，顯示這些大鼠能夠準確感知不同區(qū)域的光照強度，具有明顯的趨暗現(xiàn)象，并對新鮮環(huán)境表現(xiàn)出較強的探索能力，反映了大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)處于明顯興奮狀態(tài)。與此相比，模型組P1 和 P2 的活動范圍小，運動距離和站立次數(shù)均顯著降低，提示大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮度程度較低，探索“意愿”較差，處于“神疲”狀態(tài)。在大鼠雙前肢抓力方面，結(jié)果顯示模型組 P1 和 P2 的前肢抓力分別低于對照組 P1 和 P2，提示大鼠出現(xiàn)“乏力”表現(xiàn)。

匯總上述實驗結(jié)果，可以看出，模型組 P1 的體質(zhì)量、進食 / 水量、曠場中運動距離和垂直活動次數(shù)，以及前肢抓力等，均顯著低于對照組 P1，表明該組大鼠出現(xiàn)了消瘦、食少、神疲和乏力等類人癥狀，處于脾氣虛狀態(tài)。而模型組 P2 的上述指標與肛溫均顯著低于對照組 P2，且大便含水率顯著增加，說明該組大鼠除了產(chǎn)生脾氣虛的類人癥狀外，還有畏寒和便溏現(xiàn)象，已經(jīng)處于脾陽虛狀態(tài)。此外，通過模型組 P1 和 P2 之間的比較，還可以發(fā)現(xiàn)脾陽虛時大鼠的體質(zhì)量、肛溫、運動距離和站立次數(shù)明顯低于脾氣虛，大便含水率顯著高于脾氣虛，但兩者在進食 / 水量方面沒有明顯差異，這些說明從脾氣虛發(fā)展為脾陽虛時，盡管大鼠的納少癥狀沒有進一步加重，但大鼠更加消瘦，神疲和乏力更為嚴重，并出現(xiàn)了畏寒和便溏等較為明顯的寒象。

綜上所述，本研究所采用的階段式造模方法和評價標準，能夠成功地復(fù)制大鼠的有限性脾陽虛證模型，并且在消瘦、神疲、乏力、畏寒和便溏等方面與脾氣虛進行有效區(qū)分。