Wnt 非經(jīng)典途徑對小鼠阿爾茨海默病模型的作用及機(jī)制的初步探討

【摘要】 目的 探討 Wnt 非經(jīng)典途徑對小鼠阿爾茨海默病模型的作用以及機(jī)制。方法 選取 90 只 4 個月齡的SD 雄性小鼠，隨機(jī)均分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組 15 只。正常對照組不予處理，假手術(shù)組注入一定量的生理鹽水，模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的小鼠用基底核注射海人藻酸建立阿爾茨海默病模型，造模成功后連續(xù)給藥氯化鋰，經(jīng)過小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)測定被動回避次數(shù); 處死小鼠后，測定腦組織中白細(xì)胞介素 1β( IL － 1β) 、白細(xì)胞介素 6( IL － 6) 、腫瘤壞死因子( TNF － α) 的濃度變化。結(jié)果 模型組、低劑量組的被動回避次數(shù)與假手術(shù)組比較明顯升高( P ＜ 0． 05) ，高、中劑量組小鼠與模型組比較被動回避次數(shù)均明顯降低( P ＜ 0． 05) ; 與模型組比較，低、中和高劑量組細(xì)胞因子 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 明顯下降( P ＜ 0． 05) ，且中、高劑量組下降更顯著( P ＜0． 05) 。結(jié)論 高、中劑量組劑量的氯化鋰能顯著改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績，且療效均優(yōu)于低劑量氯化鋰。氯化鋰 Wnt非經(jīng)典途徑對小鼠阿爾茨海默病模型起積極的作用，有助于改善阿爾茨海默病。

【關(guān)鍵詞】 小鼠 阿爾茨海默病 Wnt 非經(jīng)典途徑 氯化鋰 機(jī)制

Wnt 是分泌性蛋白，Wnt 的受體為 Frizzled 或低密度脂蛋白相關(guān)蛋白( LＲP) ，兩者相結(jié)合時，就可以激活下游的信號通路。這些信號通路是一系列的，主要可以分為經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路兩組，非經(jīng)典的通路包括PCP 通路和 Wnt / Ca2 +的通路。Frizzled 受體包括 Friz-zled － 5、Frizzled － 1 等等，Wnt配體包括 Wnt8b 、Wnt7a、Wnt7b、Wnt5a 、Wnt3a、Wnt2b 等等，這些不同的配體會激活相應(yīng)的不同受體。Wnt 非經(jīng)典通路的配體或受體基本上是 Wnt5a 或 Friz － zled － 5，當(dāng) Wnt5a 配體與其Friz － zled － 5 受體結(jié)合后就會激活下游的通路。當(dāng)通路被激活以后，所形成的 Wnt － Frizzled 復(fù)合物接下來就會激活蛋白 dishevelle( DVL) 。對于 Wnt 的經(jīng)典通路來說是控制細(xì)胞命運(yùn)的通路，激活的 DVL 會使糖原合成酶激酶 3β 受到抑制，即 p － 糖原合成酶激酶 3β 增加，最終導(dǎo)致 β － catenin 的穩(wěn)定性增強(qiáng)。β － catenin 有較強(qiáng)的穩(wěn)定性以后，會通過轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)入到細(xì)胞核中，細(xì)胞核中有核轉(zhuǎn)錄因子 TCF/LEF 家族，β － catenin 就會與核轉(zhuǎn)錄因子 TCF/LEF 家族結(jié)合，這種通路來調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄。Wnt 非經(jīng)典通路有兩種，在控制組織極性和細(xì)胞運(yùn)動的 PCP 通路中，被激活的 DVL 會使 Ｒho A、JNK 、NLK 三種信號級聯(lián); 在與心臟發(fā)育原腸胚形成期調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動有關(guān)的 Wnt/Ca2 +通路中，Wnt 配體與Frizzled 受體結(jié)合后，激活 PKC 和 Ca MKII。研究 Wnt信號通路較多的是與癌癥和腫瘤有關(guān)的，Wnt 信號通路也與神經(jīng)精神類疾病息息相關(guān)，Wnt 在神經(jīng)系統(tǒng)中主要的作用是促進(jìn)海馬神經(jīng)的發(fā)生、樹突發(fā)育、軸突導(dǎo)向以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等。本研究就對 Wnt 非經(jīng)典途徑對小鼠阿爾茨海默病模型的作用以及機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1． 1 材料及造模 本研究選取 90 只 4 個月齡的 SD 雄性小鼠，體質(zhì)量為 24 ～ 28 g，均購自湖南省實(shí)驗(yàn)動物研究中心。購來后用鼠籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，讓其自由攝食與飲水。隨機(jī)均分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組 15 只。接下來建立阿爾茨海默病的模型小鼠，模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的小鼠先用 1% 戊巴比妥鈉( 20mg / kg) 進(jìn)行麻醉，用腦立體定位儀（上海欣軟公司提供）上將其固定，把顱骨線處的皮膚剪開確定 Meynert 基底核( nb M) 的位置，然后在顱骨上鉆直徑約 1． 0 mm 的小孔，在 nb M 的兩側(cè)用微量注射器注入 1 μl 的海人藻酸，為了破壞該區(qū)域的膽堿能細(xì)胞，要慢慢地注入海人藻酸，最好停針 5min。術(shù)后及時進(jìn)行術(shù)后處理，不僅要縫合皮膚，而且為了避免感染要按時給予小鼠青霉素，連續(xù) 3 d。15 只正常小鼠作為正常對照組不予處理，假手術(shù)組僅按照同法注入等量的生理鹽水。

1． 2 方法

1． 2． 1 實(shí)驗(yàn)方法 用蒸餾水制備氯化鋰溶液，并制備氯化鋰的高濃度溶液( 20 mg /ml) 、中濃度溶液( 15 mg /ml) 、低濃度溶液( 10 mg / ml) 。成功后第 2

天除正常對照組、假手術(shù)組、模型組灌服等容量的蒸餾水外，其它各組均按上述劑量灌服相應(yīng)藥物，均按照每天 5 ml/kg 體積給藥，每天 1 次，連續(xù) 15 d，整個實(shí)驗(yàn)過程小鼠每隔 3d 稱重 1 次，并依次調(diào)整給藥劑量。在灌胃給藥過程中，各組均有 3 只小鼠死亡，最終進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的小鼠每組有 12 只。

1． 2． 2 小鼠學(xué)習(xí)記憶檢測 通過小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)法（上海欣軟公司提供），設(shè)計考察氯化鋰對模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。跳臺實(shí)驗(yàn)是一種一次性刺激回避反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。術(shù)后第 10天進(jìn)行小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)，先將小鼠放在電柵上，當(dāng)電柵通電時就會有電擊，小鼠受到電擊就會跳上平臺，通過跳臺軟件控制，小鼠再次跳下平臺后又會受到電擊，然后又會跳回平臺，并記錄每只鼠受到電擊的次數(shù)，小鼠受到電擊跳上平臺稱之為被動回避反應(yīng)。1 d 后再次測驗(yàn)時，先將小鼠放在跳臺上，記錄第一次跳下的時間( 即為潛伏期) ，小鼠被動回避反應(yīng)，作為學(xué)習(xí)記憶成績，連續(xù)檢測 5 d。觀察小鼠的記憶保持情況。

1． 2． 3 小鼠海馬組織 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 的測定術(shù)后第 2 天給藥處死小鼠，斷頭，取腦組織 0． 2 ～ 1． 0g，在生理鹽水中漂洗，除去血漬，用生理鹽水制成 10%勻漿液。將勻漿液以 3 000 rpm 離心 5 min 后，取出上清液，冷凍。嚴(yán)格按照放射免疫試劑盒( 購自北京福瑞潤康生物技術(shù)有限) 說明步驟操作，測定計算海馬每毫克組織中 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 的含量。

1． 3 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用 SPSS 13． 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理并作比較分析。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋± s ) 表示，計量資料采用 t 檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)。P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

阿爾茨海默病( AD) 是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多見于 70 歲以上的老人，且女性較男性多，65 歲以前發(fā)病者稱為早老性癡呆，65 歲以上發(fā)病者稱為老年性癡呆。主要表現(xiàn)為記憶力障礙、失語、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙等特征，目前還沒有明確的病因，可能的因素和假說多達(dá) 30 余種。家族史是該病的危險因素之一，某些 AD 患者的家屬患同樣疾病者比率高于一般人群，還可能有先天愚型患病的危險，可見癡呆與遺傳有關(guān)。一些甲狀腺疾病、免疫系統(tǒng)疾病等軀體疾病，曾被作為該病的危險因素研究。伴有意識障礙的頭部外傷也被作為該病危險因素，而且有較多報道。此外研究猜測，免疫系統(tǒng)的進(jìn)行性衰竭等，以及獨(dú)居、生活顛簸等社會心理因素也可能成為發(fā)病的誘因。由于發(fā)病因素涉及很多方面，絕不能單純地用藥物治療。根據(jù)認(rèn)知能力和身體機(jī)能的惡化程度可以分為輕度癡呆、中度癡呆、重度癡呆三個時期。第一個時期一般表現(xiàn)為記憶減退、判斷能力下降、工作漫不經(jīng)心、情感淡漠、常有多疑等癥狀; 第二時期一般表現(xiàn)為遠(yuǎn)近記憶嚴(yán)重受損、簡單結(jié)構(gòu)的視空間能力下降、不能獨(dú)立進(jìn)行室外活動、出現(xiàn)各種神經(jīng)癥狀、常走動不停等癥狀; 第三個時期患者已經(jīng)完全依賴照護(hù)者，日常生活不能自理。對患者進(jìn)行檢查時主要是運(yùn)用神經(jīng)心理學(xué)測驗(yàn)、血液學(xué)檢查、神經(jīng)影像學(xué)檢查、腦電圖( EEG) 、腦脊液檢測、基因檢測等方法。目前臨床上對阿爾茨海默病治療的目的是控制伴發(fā)的精神病理癥狀，主要會出現(xiàn)焦慮、抑郁、精神病等精神病理癥狀，選擇相應(yīng)的藥物可以對其進(jìn)行治療。此外還要用到益智藥或改善認(rèn)知功能的藥，延緩疾病進(jìn)展。作用于神經(jīng)遞質(zhì)的藥物可以加強(qiáng)中樞膽堿能活動，改善老年人的學(xué)習(xí)、記憶能力。腦代謝賦活藥物可以擴(kuò)張腦血管，增加腦皮質(zhì)細(xì)胞對氧、氨基酸等的利用，改善腦細(xì)胞的功能，提高記憶力。大量研究已經(jīng)證實(shí)阿爾茨海默病發(fā)生的病理過程與 Wnt 信號通路的功能異常存在密切的關(guān)系。目前主要是通過干細(xì)胞的移植并激活其內(nèi)在的 Wnt 信號通路來促進(jìn)新生海馬神經(jīng)元的產(chǎn)生，以彌補(bǔ)海馬神經(jīng)元的丟失來治療阿爾茨海默病。細(xì)胞因子 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到重要的作用，有助于機(jī)體的生長發(fā)育和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在病理狀態(tài)下，這些細(xì)胞因子異常表達(dá)，發(fā)生炎癥反應(yīng)，損傷組織細(xì)胞，氯化鋰( Li Cl) 在發(fā)揮藥物作用時主要通過 Wnt 非經(jīng)典等信號途徑，對一些異常細(xì)胞因子的表達(dá)和活性具有明顯的抑制作用，對神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，改善患者的記憶和判斷能力。Li Cl 作為高度選擇性的抑制劑，在科研工作中用于 Wnt 非經(jīng)典信號途徑的激動，在心肌細(xì)胞分化等過程中起到了重要作用，通過抑制細(xì)胞因子 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 的活性來改善心肌細(xì)胞。

本研究采用基底核注射海人藻酸建立阿爾茲海默癥模型，導(dǎo)致 nb M 膽堿能大神經(jīng)元潰變，從而損害從nb M 到新皮層的膽堿投射系統(tǒng)，大腦皮層和海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性和乙酰膽堿酯酶活性降低，最終導(dǎo)致明顯的學(xué)習(xí)和記憶功能改變。在記憶研究中，一個最重要的動物模型就是抑制模仿活動或?qū)W習(xí)習(xí)慣。被動回避實(shí)驗(yàn)通過動物學(xué)會去掉某種特定的行為而逃避某種討厭的事情。小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)操作簡便易行，一次可同時觀察多只動物，能較客觀地反映動物經(jīng)過一次刺激后記憶獲得的情況，可分析益智藥物的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對照組與假手術(shù)組在行為學(xué)方面無明顯差異( P ＞ 0． 05) ; 但是與假手術(shù)組比較，模型組、低劑量組的被動回避次數(shù)在訓(xùn)練的 5 d 內(nèi)均明顯升高( P ＜ 0． 05) ，而高劑量組、中劑量組無明顯差異( P ＞ 0． 05) 。與模型組比較，高劑量組、中劑量組小鼠被動回避次數(shù)在訓(xùn)練的 5 d 內(nèi)均明顯降低( P ＜0 ． 01 ) ，低劑量組自訓(xùn)練的第 15 天開始被動回避次數(shù)也明顯降低( P ＜ 0． 05) 。結(jié)果表明，高劑量組、中劑量組能顯著改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績，且療效均優(yōu)于低劑量組。經(jīng)藥物干預(yù)后，細(xì)胞因子 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 明顯下降(

P ＜ 0 ． 05 ) ，中劑量組、高劑量組下降更顯著( P ＜ 0． 05) 。

4 結(jié)論

總之，高、中劑量氯化鋰能顯著改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績，且療效均優(yōu)于低劑量氯化鋰，氯化鋰 Wnt 非經(jīng)典途徑對小鼠阿爾茨海默病模型起積極的作用，有助于改善阿爾茨海默病。