絲瓜提取物對衰老小鼠學習記憶力、腦組織形態(tài)學及免疫功的影響

目的:觀察絲瓜提取物對衰老小鼠學習記憶能力、腦組織形態(tài)學及免疫功能的影響。

方法:經(jīng)篩選的昆明種小鼠隨機分為對照組、衰老組、ALL瓜提取物187.5 mg/kg,375 mg/kg,750 mg/kg3個劑量組。除對照組以外，均在頸背部皮下持續(xù)注射D伴乳糖復制衰老模型，利用跳臺實驗及Morris水迷宮測試各組小鼠學習記憶能力，臟體比方法測定各組小鼠腦指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，ELISA法檢測各組小鼠血清中細胞因子ILK, IFN、的濃度和T淋巴細胞增殖活性，HE染色法觀察各組小鼠腦組織形態(tài)學變化。結(jié)果:衰老組在跳臺實驗的能力測試中錯誤次數(shù)增多;在水迷宮測試中逃避潛伏期延長，平臺象限游泳時間縮短，穿越平臺次數(shù)減少;腦組織細胞數(shù)量明顯減少;腦指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)減少;IL 2,IFN、水平和T淋巴細胞增殖活性降低;與衰老組比較，絲瓜提取物(375 mg/kg,750mg/kg)可明顯拮抗上述指標變化。結(jié)論:絲瓜提取物可以改善衰老小鼠的學習記憶，同時增加機體免疫活性，達到延緩衰老進程的作用。

關(guān)鍵詞 絲瓜提取物;衰老;;D-半乳糖;學習記憶能力;形態(tài)學

衰老是分子、細胞、器官乃至整個機體功能衰退的復雜的生理、病理變化過程。學習和記憶能力減退是腦功能衰退的表現(xiàn)，其機理是氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化效應。絲瓜系葫蘆科植物具有豐富的營養(yǎng)價值。有報道絲瓜提取物有抗應激、抗病毒、促進生長及增強免疫等功能。有研究顯示絲瓜的果、葉和藤的提取物可增強正常小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)酸性磷酸酶的活性以及巨噬細胞吞噬功能的作用。證明絲瓜提取物對正常小鼠免疫功能的影響。絲瓜中分離得到的黃酮類物質(zhì)可能是其發(fā)揮體內(nèi)抗氧化作用的主要物質(zhì)。而絲瓜提取物對衰老模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用還少見報道，實驗主要觀察絲瓜提取物對D-半乳糖致衰老小鼠行為記憶及免疫調(diào)節(jié)的影響。

材料與方法

1. 1試驗藥物 絲瓜提取物為比例提取物，由西安森冉生物有限公司提供，通過80目篩，棕黃色精細粉末，1g提取物相當于15g生藥。腦復康(毗拉西坦片)，購自上海信誼藥廠有限公司，批號:201309030

1.2動物 選取72只雄性昆明種小鼠，SPF級，體重25 -35g，許可證號:SCXK(預)2010-00020

1.3試劑 D-半乳糖(上海試劑二廠);RPMI-640培養(yǎng)液(上海元龍生物技術(shù)有限公司)

1.4儀器  XR-3TB小鼠跳臺分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)，XR-XM101 Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)，高速冷凍離心機(上海創(chuàng)賽科學儀器有限公司)，酶標儀(ELX一80型)，紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，C02培養(yǎng)箱(BPN-150CH)。

1.5方法 小鼠按體重隨機分為正常組、模型組、絲瓜提取物187.5 mg/kg,375 mg/kg,750mg/kg劑量組;除正常組外，其余各組小鼠頸背部皮下注射D伴乳糖150mg/kg，連續(xù)8周，誘導衰老模型;同時，陽性對照組小鼠灌胃給予腦復康800mg / kg、分別灌胃給予187.5 mg/kg,375 mg/kg,750mg/kg劑量的絲瓜提取物，同時正常組和模型組小鼠給予等體積的0. 9%生理鹽水灌胃。8周后，對各組小鼠的學習記憶能力進行測試。

1. 5. 1跳臺實驗 待環(huán)境適應3min后取出，箱底通以36V的交流電，其正常反應是跳到平臺上以躲避電擊，將小鼠放入絕緣平臺上，動物從跳到平臺上至第1次跳下的時間為潛伏期和5min內(nèi)受電擊的次數(shù)(錯誤次數(shù))，記錄為學習前潛伏期和錯誤次數(shù)，作為小鼠的學習成績;24h后，重復操作一次，記錄學習后潛伏期和錯誤次數(shù)，作為小鼠的記憶成績。

1.5.2Morris水迷宮定位航行實驗及空間探索實驗 水迷宮的水池分為4個象限，迷宮上方安置著連接顯示系統(tǒng)的攝像機，同步記錄小鼠運動軌跡。實驗過程中水池周圍的參照物保持不變。實驗分為前5天的定位航行實驗與第6d的空間探索實驗。(1)定位航行實驗:歷時5天，每天1次。分別從四個象限將小鼠頭朝池壁入水，自動攝像系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)處理，記錄小鼠120秒內(nèi)找到平臺的時間(即逃避潛伏期)。超過120秒找不到平臺，可引導其找到平臺，滯留平臺15秒，逃避潛伏期記成120秒。(2)空間搜索實驗:第6天撤去平臺，小鼠隨機在一象限而向池壁放入水中，之后入水均固定于此象限，記錄120秒內(nèi)平臺所在象限的游泳時間和穿越平臺次數(shù)。

1.5.3小鼠腦、胸腺和脾臟指數(shù)測定 學習記憶實驗結(jié)束后，準確稱其體質(zhì)量后脫頸椎處死小鼠，超凈工作臺中無菌取出全腦、胸腺和脾組織，用預冷的生理鹽水反復沖洗，用濾紙吸干后，用電子天平稱其重量，訓一算各臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量( mg)/小鼠體重(g)

1.5.4 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 處死小鼠后，按常規(guī)無菌操作取小鼠脾臟制備成脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1 x 10} /ml。在96孔細胞培養(yǎng)板的每孔加脾細胞0. 2m1， ConA 15ul，其終濃度為6ug/ml，1個樣品設(shè)3個復孔，以不加ConA為對照·加蓋置入5 % C02。 37℃條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。在酶標儀波長560nm處測A值，計算刺激指數(shù)(SI)=實驗孔A值/對照孔A值。

1.5.5   ELISA法檢測 血清中細胞因子ILK , IFN、的濃度 取全血標本離心20分鐘，取上清液進行檢測，嚴格按eBioscienc;e公司提供的EI1SA試劑盒中的檢測方法測定血清中細胞因子IL 2 ， IFN-r的濃度。用酶標儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。

1.5.6形態(tài)學觀察 各組小鼠跳臺實驗結(jié)束后，立即處死，迅速取腦組織，并在中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)元細胞形態(tài)變化。

2結(jié)果

2. 1對D-半乳糖誘導的衰老小鼠跳臺實驗中學習記憶的影響

  測試學習能力中，與正常對照組相比，衰老組癡呆小鼠跳上跳臺潛伏期明顯延長，錯誤次數(shù)增多，有統(tǒng)計學意義;與衰老組對比，腦復康組和絲瓜提取物375 mg/kg,750mg/kg劑量組癡呆小鼠潛伏期和錯誤次數(shù)顯著降低，有顯著差異。在測試記憶能力中，與正常對照組相比，衰老組小鼠跳下跳臺潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)增多，差別有統(tǒng)計學意義。與衰老組對比，腦復康組和絲瓜提取物375 mg/kg,750 mg/kg劑量組小鼠潛伏期明顯延長和錯誤次數(shù)顯著降低，有顯著差異。

2. 2瓜提取物對Morris水迷宮中小鼠定位航行實驗及空間探索能力實驗的影響 定位航行實驗中，各組小鼠逃避潛伏期隨著訓練時間的延長逐漸縮短;第2天實驗開始，衰老組較空白組小鼠逃避潛伏期顯著延長，提示小鼠學習記憶功能明顯損傷。第3天實驗開始，與衰老組相比，絲瓜提取物750mg/kg劑量組可顯著縮短癡呆小鼠找到平臺的潛伏期，絲瓜750mg/kg劑量組與腦復康比較實驗5天中逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義。衰老組與對照組相比，癡呆小鼠在平臺象限的游泳時間明顯縮短，繞平臺所在象限穿越次數(shù)減少;與衰老組小鼠相比，絲瓜提取物375 mg / kg, 750mg / kg劑量組及腦復康組明顯延長小鼠在平臺象限的游泳時間，絲瓜提取物各劑量組均不同程度增加癡呆小鼠穿越平臺次數(shù)，其中絲瓜提取物750mg/kg劑量及腦復康組與衰老組相比具有顯著性差異。

2. 3瓜提取物對D-半乳糖誘導的衰老小鼠腦、胸腺和脾臟指數(shù)的影響與對照組比較，衰老組小鼠腦指數(shù)、脾及胸腺指數(shù)均顯著減少，腦復康組及絲瓜提取物375 mg/kg,750mg/kg劑

量組小鼠較衰老組小鼠腦指數(shù)、脾及胸腺指數(shù)顯著增大，沒有顯著的劑量依賴性。

2. 4絲瓜提取物對D伴乳糖致衰老小鼠模型脾T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能、血清中細胞因子ILK及IFN-r的影響與對照組相比，衰老組小鼠的脾T淋巴細胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)(SI)降低，差異有顯著性意義。與衰老組相比，腦復康組及絲瓜提取物187. 5mg/kg,375 mg/kg,750mg/kg劑量組均能提高小鼠SI，差異具有統(tǒng)計學意義。與對照組相比，血清中細胞因子ILK與IFN-r，衰老組IL 2,IFN-r明顯降低，有統(tǒng)計學意義;而絲瓜提取物375 mg/kg,750m刻k}劑量組均能升高小鼠血清中ILK和IFN-r，差異具有統(tǒng)計學意義

25小鼠腦組織光學顯微鏡形態(tài)學觀蔡正常對照組腦組織細胞形態(tài)規(guī)則且結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，細胞數(shù)口較多，無變性細胞。衰老模型組小鼠腦皮層變薄，腦細胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，著色不均勻，部分核固縮，形態(tài)發(fā)生改變，可見空泡樣變化。與模型組比較，腦復康組及絲瓜提取物375 mg/kg,750mg/kg劑量組雖有輕度的細胞腫脹，但細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，數(shù)量也增多，187.5 mg/kg劑量組有少量的空泡樣變化，絲瓜提取物187.5 mg/kg,375 mg/kg,750mg/kg劑量組小鼠腦組織細胞的數(shù)量和排列均明顯得到改善

3討論

    衰老是生命過程的一個必經(jīng)階段，主要表現(xiàn)為機體對環(huán)境的適應能力減弱以至喪失，出現(xiàn)多種器官組織功能的衰退。衰老和延緩衰老的研究成為世界各國解決老年問題的熱點前沿

研究衰老和癡呆的動物模型很多，給小鼠注射D-半乳糖已成為常見的模擬衰老動物模型的方法，廣泛用于阿爾茲海默病(AD)等神經(jīng)退行性疾病的藥理研究[l0} o  Morri、水迷宮的定位航行實驗反映小鼠的空間認知能力;空間探索實驗則反映小鼠空間記憶的能力。

結(jié)果表明，絲瓜提取物明顯縮短定位航行實驗中小鼠的逃避潛伏期，空間探索實驗中明顯延長小鼠在原平臺所在象限的游泳時間，增加其穿越平臺次數(shù)。跳臺實驗屬于被動回避性反射，可以考察藥物對記憶全過程的影響，同時測定藥物對逃避潛伏期和安全平臺期的影響，可以排除藥物非特異性作用的干擾[U i7實驗結(jié)果顯示模型組小鼠跳臺實驗中學習前和學習后潛伏期縮短、錯誤次數(shù)增加。絲瓜提取物各劑量組延長跳臺實驗中學習前和學習后潛伏期、減少錯誤次數(shù)，改善衰老小鼠的學習記憶能力，成績明顯優(yōu)于模型組。在行為學層而證明了絲瓜提取物可改善記憶的能力。光鏡觀察腦組織形態(tài)學顯示，絲瓜提取物187. 5mg/kg,375mg/kg,750mg/kg劑量組小鼠皮層細胞數(shù)量明顯增多，細胞結(jié)構(gòu)改善明顯，絲瓜提取物有可能通過維持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少腦神經(jīng)細胞的衰老或凋亡，保護腦功能達到延緩衰老的作用。

衰老的免疫學說認為，免疫器官老化，免疫細胞及細胞因子發(fā)生改變，機體的免疫功能逐漸減弱，這些增齡性變化導致機體衰老和死亡率增加[U.. isl。組織器官的重量，特別是腦、胸腺、脾、肝、i i}F9等重要器官的重量變化是反映機體衰老程度的重要指標[Ua.isl胸腺是T淋巴細胞分化成熟的場所。脾臟參與體內(nèi)的多種免疫功能。老年機體的免疫功能的降低與T細胞的變化關(guān)系很大。根據(jù)淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低，可判斷機體的細胞免疫功能狀態(tài);白介素2 (ILK)和:干擾素(interferon gam-ma } IFN-r)都是主要由活化的T淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子，具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用。IL一具有促進T細胞增殖分化，增強T細胞、NK細胞活性，誘導干擾素生成的作用。IFN-r可增強抗原提呈細胞與T細胞的相互作用，進而增強T細胞輔助抗體產(chǎn)生，可活化巨噬細胞，促進其殺傷病原體和腫瘤的能力，并可活化NK細胞，提高其殺傷能力。ILK和IFN-r水平的高低是機體細胞免疫的重要標志[U sl。本實驗結(jié)果顯示模型組小鼠各項免疫指標異常，免疫器官萎縮、功能減退，淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力降低，外周血IL一含量降低，較好地反映了衰老的病理生理特征。絲瓜提取物能提高衰老模型組小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)，升高血清中ILK和IFN-r濃度水平，能顯著增強衰老小鼠細胞免疫功能。

綜上，絲瓜提取物可以改善衰老小鼠的記憶功能及保護細胞結(jié)構(gòu)功能，有保護免疫器官、提高血清中IL一和IFN、的水平及T淋巴細胞的增殖活性作用，并可能通過增強機體體液和細胞兔疫功能而起到延緩衰老的作用。