行為學研究乳清蛋白肽對衰老小鼠學習記憶的影響

摘要:行為學實驗是評價動物學習記憶能力的主要方法之一，本文選擇跳臺、穿梭箱和Morris水迷宮三種常用的行為學實驗，利用堿性蛋白酶水解制得的乳清蛋白膚，研究乳清蛋白膚對老齡小鼠學習記憶能力的影響。通過動物行為學實驗得出，灌胃乳清蛋白膚可以增加跳臺潛伏期和減少跳臺錯誤次數;減小電擊時間和次數;減少定位航行實驗中的逃避潛伏期、游泳路程、速度和朝向角，增加空間探索實驗中的目標象限停留時間、時間百分比、路程百分比、經過平臺次數和減少初次穿越平臺的時間，同時游泳軌跡也向趨向型和直線型發(fā)展。實驗結果表明，乳清蛋白膚能夠提高衰老小鼠的被動回避和空間學習記憶能力，所以通過本試驗可以為開發(fā)具有改善學習記憶能力的乳清蛋白膚產品提供理論依據。

關鍵詞:乳清蛋白膚;衰老小鼠;行為學實驗;記憶學習能力

0引言

近年來人們對乳清蛋白膚的研究逐漸成為熱點，目前已發(fā)現某些膚段具有抗氧化，降血壓’2，，降膽固醇，增強免疫力，抗毒，抗病菌’3，等多種生理功能，E.A. 1'era-Ramo、等研究發(fā)現乳清蛋白酶解物在脂質氧化體系中可以防止脂質過氧化，J，。Tuba 13ayr}'等酶解乳清蛋白，研究了其自由基清除能力，發(fā)現乳清蛋白膚具有良好的抗氧化活性;包怡紅等’川證實以全乳清為原料，利用堿性蛋白酶對乳清蛋白進行降解，水解后的多膚對Fenion體系產生的經自由基有清除能力。目前已經證實乳清蛋白膚能夠清除自由基iii，延緩機體衰老，因而可能也具有改善學習記憶的作用，但研究并不多見。木實驗選擇抗氧化活性最強的乳清蛋白膚的超濾組分進行動物行為學實驗，研究乳清蛋白膚對衰老小鼠學習記憶能力的影響。

1實驗

1.1材料與試劑

濃縮乳清蛋白，蛋白質質量分數78.29%，堿性蛋白酶，昆明種雌雄小鼠，毗拉西坦(腦復康，其余所有試劑均為分析純。

1.2主要儀器

紫外可見分光光度計，低速離心機，萬能粉碎機，RE-52型旋轉蒸發(fā)儀，XR-XM101型Morris水迷宮系統(tǒng)與XR-XC105型程控小鼠穿梭箱，XR-3TB型小鼠跳臺測試儀。

1.3方法

1.3.1乳清蛋白杭氧化膚的制備

乳清蛋白膚的制備參考卜輯的方法’“，，以Dl'1'H自由基清除率為指標，對乳清蛋白膚進行脫鹽、超濾分離，篩選出抗氧化活性最高的組分(分子量小于3 ku )，將其冷凍十燥成粉末，以備下一步實驗。

1.3.2動物行為學實驗

1.3.2.1實驗動物飼養(yǎng)及分組

動物飼養(yǎng):取雌雄昆明種小鼠80只，購買自然衰老的老年小鼠18月齡，青年小鼠3月齡，適應性飼養(yǎng)1周后，用Morris水迷宮系統(tǒng)篩選，剔除漂在水面上的小鼠，剩余72只。隨機分組(見表1)，每組雌雄小鼠數目相等，分為青年對照組，老年模型組，腦復康對照組和乳清蛋白膚低、中、高劑量組，分籠飼養(yǎng)，雌雄不同籠。每組12只，每5天稱1次體質量，老年模型組和青年對照組每天注射等量生理鹽水。低、中、高劑量組注射的乳清蛋白膚溶液是由超濾分離出的分子量小于3 ku的寡膚凍十粉配制而成。

1.3.2.2行為學實驗

連續(xù)喂養(yǎng)30 d后，于第31天按照跳臺實驗、穿梭箱實驗、水迷宮實驗的順序依次開始行為學實驗。

(1)跳臺實驗：實驗時先將小鼠放人反應箱內(臺上、臺下)適應環(huán)境3 min，然后將其放在銅柵上，立即通以3 f} V的交流電，觀察小鼠受到電擊跳回平臺以及再次跳至銅柵上的情況。如此訓練5 min，記錄每只小鼠受電擊的次數或稱錯誤次數(EN 1)，以此作為學習成績。24 h后和5 d后分別進行重復測驗，將小鼠置于平臺上，記錄各鼠第一次跳下平臺的時間，即停留潛伏期(step-down latency, SDL)和各鼠3 min內的錯誤次數(EN 1)，以此作為記憶成績。停止實驗5d后再進行1次重復實驗，記錄上述指標，作為記憶消退階段的成績。

(2)穿梭箱實驗：實驗時將小鼠放人穿梭箱內任何一側，10、后開始出現蜂鳴音，持續(xù)S   S，蜂鳴音后給予電刺激(100 V , 0.2 mA ,5o HZ,AC>，持續(xù)10 s。連續(xù)訓練4d，每天10次。記錄以下指標:電擊時間，即動物被電擊的累訓一時間;電擊次數，即在10個循環(huán)中小鼠被電擊到的次數。

(3)Morris水迷宮實驗：實驗時將平臺隨機置于第一象限并固定于水下1一1.5 cm，水溫保持在21 0C 1 1 0C 0整個實驗過程分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分。

①定位航行實驗:用于測量小鼠在水迷宮中的學習和記憶能力，實驗歷時f} d，每天訓練4次。在距離平臺所在象限的較遠象限的水池壁上標定一點，作為實驗小鼠的人水點，實驗過程保持站臺位置和小鼠落水位置不變。將小鼠沿水池壁慢慢放人水中，通過Dig13e1m-MWM視頻分析系統(tǒng)記錄小鼠從投人水池至找到并爬上平臺的時間，此為定向航行實驗逃逸潛伏期，同時記錄游泳路程、游泳速度和朝向角，以此作為評價大鼠學習能力差異的指標，每次觀察時間為90 s，若設定時間內未找到站臺，計算機停止跟蹤，記錄時間為90 s，然后通過引導使小鼠游上平臺并停留5S。每次試驗均在安靜的環(huán)境中進行，水池和光源的位置應保持不變。

②空間探索實驗:用于測量小鼠對平臺空間位置的記憶保持能力，方法為第匕天撤去平臺，以訓練時的標定點作為人水點，將小鼠放人水中，記錄12n、內小鼠在目標象限(平臺所在象限)的停留時間、目標象限停留路程、準確穿越平臺所在位置的次數及初次穿越平臺時間等指標，作為空間搜索試驗的成績，以此來判斷小鼠對空間位置的短期記憶和判斷能力。

1.4統(tǒng)計分析

文中數據均使用S1'SS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，所用數據均為三次的平均數，誤差項為標準誤，單因素方差分析(ANOVA)中采用LW  ncan檢驗。文中采用Sigma Plot 9.0軟件作圖，圖表中標有相同字母者為差異不顯著，有不同字母者為差異顯著(1'0.05)0

2結果與分析

2.1跳臺實驗測試結果

表2為乳清蛋白膚對跳臺潛伏期和跳臺錯誤次數的影響。由表2可以看出，與老年模型組相比，學習5 天后，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白膚劑量組錯誤次數顯著減少;24 天后重復測驗結果顯不，乳清蛋白膚中、高劑量組的潛伏期顯著增加，錯誤次數顯著減少，乳清蛋白膚低劑量組的潛伏期無顯著變化，錯誤次數顯著減少;5 d后重復測驗結果顯不，乳清蛋白膚中、高劑量組的潛伏期和錯誤次數變化與24 h相同，而低劑量組的潛伏期和錯誤次數均無顯著變化。與青年對照組和腦復康對照組相比，學習5 min后，乳清蛋白膚劑量組的錯誤次數顯著增加;24 h后重復測驗結果顯不，乳清蛋白膚劑量組的潛伏期顯著

減少，錯誤次數顯著增加;5d后重復測驗結果與24 h變化規(guī)律一樣。

結果表明中、高劑量組乳清蛋白膚可以提高衰老小鼠的被動回避反應能力，高劑量組效果最好，低劑量組的效果不明顯。

2.2避暗實驗測試結果

圖1為乳清蛋白膚對電擊時間和電擊次數的影響。由圖1可以看出，隨著訓練天數的增加，各組小鼠的電擊時間和電擊次數均顯著減少，說明小鼠的躲避能力有所增強;采用LW  ncan法對各組的指標進行兩兩比較發(fā)現，與老年模型組相比，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白膚中、高劑量組的電擊時間和電擊次數均顯著減少，乳清蛋白膚低劑量組的電擊時間也顯著減少，但電擊次數無顯著變化;與此同時，與青年對照組和腦復康對照組相比，乳清蛋白膚劑量組的電擊時間和電擊次數均顯著增加。說明一定劑量的乳清蛋白膚雖可以提高衰老小鼠的避暗能力，但與青年和腦復康對照組相比還有一定差距。

2.3水迷宮實驗測試結果

2.3.1定位航行實驗

圖2為乳清蛋白膚對水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角的影響。

由圖2可以看出，時間與組間無交互作用;隨著訓練天數的增加，各組動物的逃避潛伏期、游泳路程和朝向角均顯著減少，游泳速度顯著增加，說明經過f}天訓練，小鼠的學習能力均有不同程度的增強。采用LW  ncan法對各組的指標進行兩兩比較發(fā)現，隨著訓練

天數的增加，與老年模型組相比，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白膚劑量組的逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角顯著減少;但分別與青年對照組和腦復康對照組相比，乳清蛋白膚劑量組的逃避潛伏期、游泳路程仍有顯著增加，游泳速度和朝向角雖然個別數值有些波動，但整體趨勢有所增加，且各組之間均存在顯著性差異。說明乳清蛋白膚在一定程

度上能夠改善衰老小鼠的學習能力。

2.3.2空間探索實驗

實驗第7天，撤去平臺后進行空間探索實驗，結果如表3所不。由表3可以看出，與老年模型組相比，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白膚劑量組在目標象限停留時間、時間百分比、路程百分比、經過平臺次數均顯著增加;初次穿越平臺的時間顯著減少;乳清蛋白膚低、中劑量組在目標象限停留路程增加;青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白膚高劑量組在目標象限停留路程減少;分別與青年對照組以及腦復康對照組相比，乳清蛋白膚劑量組在目標象限停留時間、時間百分比、路程百分比、經過平臺次數顯著減少;目標象限停留路程、初次穿越平臺的時間顯著增加;且各組之間均存在顯著性差異，與乳清蛋白膚呈良好的量效關系，說明乳清蛋白膚能夠改善衰老小鼠的空間i己}乙能力。

2.3.3水迷宮游泳軌跡類型

搜索策略是衡量動物分析判斷能力和解決問題能力的指標。水迷宮游泳軌跡如圖3所不，圖3中，小鼠的搜索策略隨著訓練次數的增加而呈現“邊緣式一隨機式一趨向式一直線式”的變化規(guī)律，學習記憶能力好的小鼠，經過3}5 d的訓練，其搜索策略以趨向式

和直線式為主(統(tǒng)稱為空間策略)，而較差的則以邊緣式和隨杉L式為主。

在定位航行與空間探索實驗中，每組10只小鼠，共游泳280次，搜索策略結果顯不(表4)，老年模型組游泳軌跡以隨機型和邊緣型為主，共188次，說明需要較長時間和游泳路程才能找到平臺;與老年模型組相比，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白膚劑量組的趨向型和直線型軌跡總數有所增加;分別與青年對照組相比以及與腦復康對照組相比，乳清蛋白膚低、中劑量組的趨向型和直線型軌跡總數有所減少，乳清蛋白膚高劑量組的趨向型和直線型軌跡總數有所增加，說明衰老小鼠的空間學習和記憶保持能力得到明顯改善。這可能是由于乳清蛋白膚具有抗氧化活性，可以清除腦內自由基，阻止脂質過氧化反應的發(fā)生，降低過氧化物的生成，從而延緩大腦的衰老，對學習記憶力具有一定改善作用。

3結論

在跳臺和穿梭箱實驗中，乳清蛋白膚灌胃后可以增加衰老小鼠跳臺潛伏期和減少跳臺錯誤次數，減小電擊時間和電擊次數，其中中、高劑量組效果顯著;在水迷宮實驗中，從整體趨勢上看，乳清蛋白膚灌胃后可以減少定位航行實驗中衰老小鼠的逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角，增加空間探索實驗中的目標象限停留時間、目標象限停留時間百分比、目標象限停留路程百分比、經過平臺次數和減少初次穿越平臺的時間，同時游泳軌跡也向趨向型和直線型發(fā)展，可見乳清蛋白膚能夠提高衰老小鼠的被動回避和空間學習i己h}能力。

但是木研究制備的乳清蛋白抗氧化膚對行為學的影響目前仍不如腦復康等西藥，與青年小鼠相比也尚存在一定差距，也許可以通過改進制備方式純化方法等，獲得具有功能性質效果更好的乳清蛋白膚，因此，在乳清蛋白膚功能特性的開發(fā)和利用，以及其對行為學的影響上，還需要進一步的研究。