1. 正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2. 在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:

（1） 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好，吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg/ml。

（3） 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

（4） 酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿(mǎn)意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

3. 標(biāo)本收集：標(biāo)本收集及保存的好壞，直接決定了實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒ΑＴ谑占瘶?biāo)本之前必須考慮到實(shí)驗(yàn)對(duì)標(biāo)本收集及保存的要求，這些要求對(duì)標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)穩(wěn)定性影響很大。以ELISA為例。ELISA檢測(cè)的一般是液態(tài)標(biāo)本，應(yīng)在收集到新鮮標(biāo)本后立即離心留取上清液1ml左右移入高溫滅菌過(guò)的1.5ml EP管中。這種標(biāo)本在4度保存48小時(shí)，-20度保存1個(gè)月，-80度保存6個(gè)月對(duì)檢測(cè)影響不大。樣本一般都是怕反復(fù)凍融的，這樣會(huì)使蛋白降解，如需做預(yù)實(shí)驗(yàn)或需反復(fù)取用標(biāo)本時(shí)，應(yīng)在收集時(shí)即分裝幾個(gè)EP管（管外注意用標(biāo)號(hào)筆標(biāo)記好）。

4. 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：100μl加樣槍及槍頭，1000μl加樣槍及槍頭，100ml量筒（洗凈并雙蒸水沖洗），500ml量杯（洗凈并雙蒸水沖洗，實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有更小的了），雙蒸水100ml（稀釋洗滌液用），吹氣球，吸水紙（定性濾紙），試管架，避光濕盒，酶標(biāo)板框，定時(shí)器，膠帶，剪刀，棄物盒及廢液缸；100μl中槍頭、1000μl大槍頭、1.5ml EP管需事先滅菌好；多次使用的酶標(biāo)板框應(yīng)洗凈烘干。

5. 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)時(shí)，預(yù)先讓37度恒溫箱升溫至37度；樣品和試劑盒在室溫下平衡30分鐘以上。

6. ELISA試劑盒固化的抗體在底部，加樣時(shí)槍頭千萬(wàn)不要碰到底部；用不完整個(gè)試劑盒可以分開(kāi)用，但分時(shí)一定不要摸底部，原因同前。 

7. 每次孵育時(shí)用膠帶封住酶標(biāo)板口，防止水份蒸發(fā)。

8. 微孔板一般是一排8個(gè)，在其一端排頭的邊緣用記號(hào)筆標(biāo)記下順序（如1，2，3...），以免手工洗板過(guò)程中板朝下拍時(shí)不慎致微孔板掉出酶標(biāo)板框而無(wú)法確認(rèn)順序。

9. 加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時(shí)每次都要更換一個(gè)槍頭，避免重復(fù)使用槍頭而交叉污染。

10. 37度溫育后千萬(wàn)不要忘記倒掉微孔板中的液體（包含未結(jié)合上的酶聯(lián)親和物，其殘留必然造成假陽(yáng)性），并且反復(fù)用稀釋好的洗滌劑洗板。 

11. 應(yīng)做預(yù)實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果多數(shù)樣本測(cè)值在最高OD值處波動(dòng)，要稀釋后再重做，然后按稀釋倍數(shù)算出來(lái)最終結(jié)果，因?yàn)樵噭┖惺怯袦y(cè)試范圍的。

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