"良好的開始是成功的一半"，尤其對于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如果沒有高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)樣本，等待我們的很可能是失敗的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。優(yōu)質(zhì)特異的蛋白樣品對Western Blot實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。下面將從蛋白樣品制備的方法和試劑選擇上給大家一些建議，同時(shí)也和大家分享一些因蛋白樣品制備不當(dāng)而導(dǎo)致Western Blot實(shí)驗(yàn)失敗的案例。

√ 蛋白樣品制備的基本原則

    目的蛋白因其物種來源和組織特異性的不同，在種類和性質(zhì)上有很大差異，因此并沒有一種制備方法可以適用于所有蛋白的提取。這就需要我們進(jìn)行全面的分析后才能選擇最合適的蛋白制備方法，在這個過程中遵循的一個基本原則是"知己知彼"。

    首先，"知己"是要了解：樣品是來自什么物種？目的蛋白定位在哪種組織或細(xì)胞器？是可溶蛋白還是不可溶蛋白？是高豐度蛋白還是低豐度蛋白？在制備時(shí)需要保持蛋白的天然活性，還是需要變性蛋白？

    其次，"知彼"是要知道：哪種方法或試劑能夠防止蛋白降解、聚集、沉淀、變性、修飾？哪種能夠去除高豐度蛋白干擾，富集低豐度蛋白？哪種能去除核酸、多糖、脂肪等雜質(zhì)？哪種能在有限的實(shí)驗(yàn)條件下，簡便快速地獲得高純度且完整性好的蛋白？

    遵循"知己知彼"的原則對蛋白樣品制備進(jìn)行全面分析，就能明確蛋白樣品制備的合適方法或試劑。

√ 細(xì)胞組織裂解液的選擇

    裂解液是最普遍使用的蛋白提取試劑，可根據(jù)文獻(xiàn)或經(jīng)驗(yàn)自行配制，也可購買商業(yè)化的產(chǎn)品。常見的細(xì)胞裂解液有NP40、Triton X-100、RIPA buffer等。下表是根據(jù)目的蛋白的不同定位選擇裂解液的建議。雖然裂解液的使用范圍比較廣泛，能夠滿足總蛋白的提取，但是無法做到特異蛋白的提取，特別是遇到低豐度蛋白或者活性蛋白功能分析時(shí)，通用型的裂解液存在很大的局限性。

√ 蛋白抽提試劑盒的選擇

    蛋白抽提試劑盒的出現(xiàn)彌補(bǔ)了細(xì)胞裂解液的應(yīng)用局限性，特別是針對難提取的樣本或者亞細(xì)胞器蛋白的提取，例如：針對植物、動物組織/細(xì)胞、細(xì)菌、酵母等不同樣品及細(xì)胞核、細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體、溶酶體等不同亞細(xì)胞器的專業(yè)提取試劑盒。這類特化試劑盒能夠針對目的蛋白的不同來源和不同組織定位進(jìn)行裂解和提取，簡化實(shí)驗(yàn)操作的同時(shí)還能提高蛋白提取的得率。

   如Vazyme公司的總蛋白提取試劑盒：一方面，該系列試劑盒有非變性的裂解配方，可最大程度地保留蛋白活性；另一方面，該系列產(chǎn)品無需經(jīng)過反復(fù)凍融、超聲破碎等傳統(tǒng)物理裂解方法，并能在很短時(shí)間內(nèi)得到高純度的蛋白。

√ Western Blot中的蛋白樣品危機(jī)

    在Western Blot中如果蛋白樣品制備不當(dāng)，可能會造成無信號、弱信號、條帶大小不正確等實(shí)驗(yàn)問題。下表就此類實(shí)驗(yàn)問題給出案例分析和解決方案，供參考。

    以上是關(guān)于Western Blot實(shí)驗(yàn)過程中如何選擇合適的蛋白制備方法和試劑的一些建議，以及由于蛋白樣品制備不當(dāng)造成實(shí)驗(yàn)失敗的問題總結(jié)，希望能給大家一些幫助和啟發(fā)。此外， Western Blot還有很多關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)需要注意，比如怎樣選擇高質(zhì)量的抗體、怎樣保護(hù)蛋白樣品不被降解、怎樣配制合適的SDS-PAGE凝膠等，都應(yīng)操作小心謹(jǐn)慎。