研究背景

    胚胎干細胞具有自我更新和分化的全能性。但是，胚胎干細胞發(fā)育分化的分子機制目前還不是很清晰。研究胚胎干細胞調(diào)控機制有助于對胚胎的形成及胚胎發(fā)育相關(guān)的疾病有更深入了解。來自同濟大學(xué)的研究人員通過在小鼠胚胎干細胞中研究一個WD-4蛋白——PWP1，為我們展現(xiàn)了該基因在調(diào)控胚胎干細胞分化過程中的重要作用。

研究思路

1.PWP1影響了胚胎干細胞發(fā)育過程的哪個階段呢？

     胚胎干細胞有著活躍的細胞增殖和自我更新活動。Pwp1作為細胞周期調(diào)節(jié)子，在胰腺癌中異常表達，為了探究Pwp1基因在胚胎干細胞中的影響，研究人員首先在胚胎干細胞（mESCs）和胚胎纖維母細胞（MEFs）中檢測了Pwp1及全能性markers基因的表達。結(jié)果顯示Oct4,Sox2和Nanog在MEFs中比mESCs中低，Pwp1在分化的ESCs中表達降低。為了研究Pwp1降低引起的細胞變化，研究人員構(gòu)建了knowdown的ESCs細胞系shPwp1 A和shPwp1 B。結(jié)果顯示，Pwp1 KD沒有改變細胞的形態(tài)和堿性磷酸酶活性，多能性markers基因的表達沒有明顯變化，只有Rex1和Klf4表達上調(diào)。細胞增殖檢測表明Pwp1 KD后也沒有發(fā)生明顯變化，mES二次克隆形成也沒有在Pwp1 KD后有所抑制。因此，細胞中Pwp1 KD沒有影響ESCs細胞的增殖或自我跟新過程。
    既然Pwp1不影響ESCs細胞的增殖，那么是否會影響其分化過程呢？結(jié)果顯示，Pwp1 KD后的細胞更偏向于保持在克隆形態(tài)，即ESC分化顯著降低。qRT-PCR檢測顯示3個胚芽層相關(guān)基因的表達也明顯低于對照。因此，Pwp1基因影響了ESCs細胞的分化過程。為了更嚴格的說明Pwp1的分化作用，研究人員在畸胚瘤模型進行了驗證。結(jié)果過顯示，Pwp1 KD后不能檢測到明顯的胚芽層。因此，Pwp1對mES 分化非常重要。

     細胞周期和細胞凋亡也是mESCs自我更新的重要過程。Pwp1 KD是否影響了細胞周期和凋亡而影響細胞分化呢？結(jié)果顯示，Pwp1 KD后細胞周期沒有顯著改變，PCNA蛋白水平也沒有明顯變化，細胞周期相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達也沒有變化。同時，細胞凋亡在Pwp1 KD后沒有明顯變化。因此，Pwp1不是通過細胞周期或凋亡影響mESC的分化過程。

2. PWP1通過影響哪些下游通路調(diào)控mESC細胞分化呢？

     既然Pwp1 KD影響了ESCs的分化過程，那么，具體調(diào)控的基因是誰呢？研究人員選擇了Aglient全基因組表達譜芯片（該服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供）作為篩選工具進行了檢測。通過對EBDay 0, EBDay 3和EBDay 6的Pwp1 KD組與對照組比較差異基因，分別用GSEA篩選三個不同胚芽層基因后發(fā)現(xiàn)，中胚層和內(nèi)胚層基因顯著下調(diào)。同時，Pwp1 KD中的分化相關(guān)markers基因表達也顯著比對照低。

     Pwp1是通過調(diào)控了下游哪些通路影響分化過程呢？通過對基因芯片篩選到的差異基因進行GSEA通路分析，發(fā)現(xiàn)Jak/Stat3和Wnt/β-Catenin信號通路顯著改變。qRT-PCR和Western blotting驗證顯著Stat3表達顯著增加，同時其下游基因Klf4,c-Myc和Socs3的表達也顯著增加。Wnt信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子表達降低，而Gsk3β等該通路調(diào)控基因表達并沒有顯著變化。因此，Pwp1可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，特別是Jak/Stat3通路影響了ESCs細胞的全能性。

    為了驗證Jak/Stat3和Wnt/β-Catenin通路對ESCs分化的調(diào)控作用，研究人員分別用Jak/Stat3抑制劑AG490和Gsk3β抑制劑SB216763處理Pwp1 KD和對照細胞系。結(jié)果顯示，AG490（30 uM）恢復(fù)了細胞的分化形態(tài)，而SB216763沒有顯著影響。mRNA和蛋白檢測顯示這兩個通路基因沒有變化。磷酸化檢測顯示STAT3在AG490處理后顯著減少。為了更加深入的研究Pwp1調(diào)控Stat3的作用機制。研究人員在Pwp1 KD 細胞系中敲除了Stat3。結(jié)果顯示，細胞分化抑制被消除了。因此，Pwp1可能是通過調(diào)控下游Stat3的表達而影響分化過程。

3. Pwp1是怎么樣通過Stat3信號通路調(diào)控ESCs分化過程呢？
    
   已有研究表明，WD-40蛋白調(diào)控了H3K4的甲基化過程。結(jié)果顯示Pwp1 KD也減少了細胞中的H4K20me3的表達水平。Dox處理實驗表明H4K20me3顯著下調(diào)，免疫組化實驗也驗證H4K20me3在Pwp1 KD后顯著下調(diào)。此外，PWP1 ChIP-seq鑒定到5,639個結(jié)合位點，與H4K20me3 ChIP-seq的結(jié)果一致。免疫共沉淀表明PWP1和H4K20me3能結(jié)合。ChIP-PCR結(jié)果顯示，PWP1和H4K20me3都可以和Stat3 DNA序列上的上游的兩個位點結(jié)合。因此，該結(jié)果表明通過與H4K20me3結(jié)合，PWP1靶定到Stat3的上游抑制了它的表達。

研究結(jié)論

    該研究表明，Pwp1蛋白，在mESCs分化過程中扮演了重要的角色。通過表達譜芯片篩選，GSEA通路分析和后期實驗驗證找到了下游調(diào)控基因Stat3。進一步的ChIP-seq等實驗表明PWP1與H4K20me3相互作用，結(jié)合到Stat3上游位點影響了Stat3的表達，最終影響了ESCs的早期分化過程。

個人點評
    
    該研究是典型的基因功能分子機制研究。當我們想研究某一個基因在某個生物學(xué)過程中的作用時，第一步就是確認該基因引起的生物學(xué)表型。接下來一步就是下游功能基因的篩選，通過基因過表達和敲除細胞系，借助于高通量基因芯片或者二代測序手段，篩選下游差異表達基因。最后通過生物通路分析和實驗驗證工作來揭示某基因是怎么樣具體通過調(diào)控了下游的基因，進而影響了某個生物學(xué)過程。而這樣一種思路的研究一般能發(fā)表5分以上的高影響因子文章，因此非常值得大家借鑒參考。

原文出處：

Shen JW, Jia WW, Yu YY, Chen J, Cao XK, Du YH, Zhang XB, Zhu SC, Chen W, Xi JJ, Wei TY, Wang GY, Yuan DL, Duan T, Jiang CZ,Kang JH. Pwp1 Is Required for the Differentiation Potential of Mouse Embryonic Stem Cells Through Regulating Stat3 Signaling. Stem cells2015;33:661–673.