免疫熒光技術（Immunofluorescence technique）

1941年，Coons等于首次采用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術（fluorescent antibody technique）。該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。

一、熒光免疫技術的概念：

免疫熒光技術（Immunofluorescence technique）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。將抗原或抗體用熒光素進行標記，標記的抗原或標記的抗體與相應的抗體或抗原反應后，測定復合物中的熒光素，這種免疫技術稱為免疫熒光素技術。免疫熒光細胞化學分直接法、夾心法、間接法和補體法。

二、熒光免疫技術分類：

（1）熒光抗體顯微鏡技術：抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。

（2）免疫熒光測定技術： 抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法

三、熒光的產(chǎn)生：

物質吸收外界能量而進入激發(fā)狀態(tài)，在回復基態(tài)時多余的能量以電磁輻射的形式釋放，即發(fā)光，這種光稱為熒光。這種物質，稱為熒光素。由光激發(fā)所引起的熒光，為光致熒光；由化學反應所引起的熒光，為化學熒光。

四、熒光素的熒光特性：

（1）停止供能，熒光現(xiàn)象隨即終止

（2）對光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性入射光波長<發(fā)射光波長

（3）熒光效率：熒光效率=發(fā)射熒光的光量子數(shù) /吸收光的光量子數(shù)

（4）熒光猝滅現(xiàn)象：熒光素的輻射能力減弱

五、常見熒光素：

（1）異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC純品為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構體，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質結合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm，最大發(fā)射光波長為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。

（2）四乙基羅丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為 570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。

（3）四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。因其熒光淬滅慢，也可用于單獨標記染色。

（4）鑭系：鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應用最廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。

（5）藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進行光合作用的自然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，最大吸收峰為564 nm，當使用488 nm激光激發(fā)時其發(fā)射熒光峰值約為576 nm，對于單激光器的流式細胞儀來說，推薦使用585±21nm的帶通濾光片，雙激光器的流式細胞儀推薦使用575±13nm的帶通濾光片。FL2探測器檢測PE。

（6）多甲藻葉綠素蛋白 （peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復合物，分子量約為35kD，最大激發(fā)波長的峰值在490nm附近，當被488nm氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值約為677nm。FL3探測器檢測PerCP。

（7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可選擇性地嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對中。在對DNA染色時，需用RNase對細胞進行處理，以排除RNA對DNA熒光定量精度的影響。在488nm波長激發(fā)下，PI的發(fā)射光譜為610-620nm。 FL2探測器檢測PI。

常見熒光素的特性：

（1）FITC：黃色結晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。

（2）RB200：橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光595~600nm，橘紅色熒光。

（3）TRITC：紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光620nm，橙紅色熒光。

（4）鑭系：Eu、Tb

（5）PE：吸收光490～560nm，發(fā)射光595nm，紅色熒光。

（6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質。

酶作用后產(chǎn)生熒光物質：

酶	底物	產(chǎn)物	激發(fā)光	發(fā)射光
B-G	MUG	MU	360	450
AP	MUP	MU	360	450
HRP	HPA	二聚體	317	414

酶作用后產(chǎn)生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質。例如，4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。鑭系螯合物 某些3價稀土鑭系元素如銪 (Eu3+)、鋱 (Tb3+) 等的螯合物可發(fā)射特征性的熒光，而且激發(fā)光波長范圍寬、發(fā)射光波長范圍窄、熒光衰變時間長，最適合于時間分辨熒光免疫測定。

六、合適熒光素的選擇：

（1）具有與蛋白質形成共價鍵的化學基團。

（2）熒光效率高，標記后下降不明顯。

（3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。

（4）標記后能保持生物學活性和免疫活性。

（5）標記方法簡單、快速。

（6）安全無毒 。