摘要：

目的 探討瘦素 (Leptin) 與顳葉癲癇發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的關(guān)系。

方法 外源 Leptin 注射 C57BL/6J 小鼠后，右側(cè)海馬微量 注射 200 ng 海人酸 (kainic acid，KA) 誘導(dǎo)顳葉癲癇，記錄小鼠癲癇評(píng)分，1 周后觀察小鼠海馬病理變化，包括 Western blot 檢測(cè) Bax 的表達(dá)水平，尼式染色 (Nissl staining) 觀察海馬 Hilus 區(qū)神經(jīng)元丟失，免疫熒光檢測(cè) Hilus 區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與 增殖。結(jié)果 在 200 ng KA 誘導(dǎo)的顳葉癲癇模型基礎(chǔ)上，10 mg/kg 外源 Leptin 預(yù)處理后，癲癇評(píng)分增加約 52%，Bax 表達(dá)水 平升高約 75%(P ＜ 0.05)，海馬 Hilus 區(qū)神經(jīng)元丟失嚴(yán)重，星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化。

結(jié)論 Leptin 增加了 KA 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋 亡，加重 KA 誘導(dǎo)的神經(jīng)病理過(guò)程。

材料和方法

1 材料　C57BL/6J 小鼠 (SPF 級(jí)，60 只 )，8 周齡， 雄性，體質(zhì)量 20 ~ 22 g，購(gòu)自解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；標(biāo)準(zhǔn)飼料 (10% KJ%fat，飼料 ) ；海人酸 (kainic acid，KA)(Sigma Chemical Co. St Louis，MO，USA) ；人重組 Leptin(Peprotech公司 ) ；三羥甲基氨基甲烷 (Tris 堿 )( 北京益利精 細(xì)化學(xué)品公司 ) ；腦立體定位儀 (ZS-B/C，北京眾 實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司 ) ；5μl 微量進(jìn)樣 器 Microliter Syringes( 上海高鴿工貿(mào)有限公司 ) ；乙醚 ( 北京益利精細(xì)化學(xué)品公司 ) ；甲苯胺藍(lán) (Sigma Chemical Co. St Louis，MO，USA) ；RIPA 裂解液、 BCA 蛋白定量試劑盒、Western Blot 超敏發(fā)光液 ( 北京普利萊基因技術(shù)公司 ) ；一抗 ：Bax(Epitomics 公司 )，β-actin(Santa Cruz) 膠質(zhì)纖維酸性蛋白 (GFAPCell Signaling Technology Inc. #3670)、 瘦 素受體 (ObR，Santa Cruz Biotechnology) ；二抗：山 羊抗鼠 Alexa Fluor(R)488，山羊抗兔 Alexa Fluor(R) 555(1 ∶ 400，Cell Signaling Technology Inc.)、山羊 抗兔 IgG/ 辣根酶標(biāo)記 ( 北京中衫金橋公司 ) ； Hochest33342(Sigma) ；檸檬酸鹽緩沖液 ( 北京普利 萊基因技術(shù)公司 )。

2 顳葉癲癇小鼠模型的建立 [5]　將 C57BL/6J 小鼠 分為 0.9% 氯化鈉注射組 ( 對(duì)照組，10 只 )，Leptin將硝酸纖維素膜放入含 5% 脫脂奶粉 (TBST 溶解 ) 塑料袋中，放入搖床 37℃封閉 1 h，將稀釋好的一 抗，Bax(1 ∶ 1 000)、β-actin(1 ∶ 500)，4℃封閉 過(guò)夜。取出后放室溫 30 min，TBS/T 漂洗膜 3 次 ×10 min，加入稀釋好的二抗 (1 ∶ 3 000)，37℃孵育 30 min，TBS/T 漂洗硝酸纖維素膜 3 次 ×10 min，加入發(fā)光液，暗室曝光。掃描后，使用 Image Plus 6.0 軟件，分析其灰度值，3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)求平均值。

1.尼式染色 (Nissl staining) 4 μm 石蠟切片脫蠟 至水，用磷酸鹽緩沖溶液洗 2 min，放 1% 甲苯胺 藍(lán)溶液中室溫 20 min，用梯度酒精依次脫水，結(jié) 果尼式小體呈深藍(lán)色顆粒，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，背 景基本無(wú)色。

1.免疫熒光雙染法觀察 ObR 和 GFAP 共表達(dá) 注射海人酸后的小鼠冠狀面石蠟切片 (4 μm) 脫蠟 至水，檸檬酸鹽緩沖溶液高壓修復(fù) 5 min，5% 山 羊血清封閉，加入一抗瘦素受體 (ObR) 和膠質(zhì)纖維 酸性蛋白 4℃過(guò)夜，漂洗后，加二抗 Alexa Fluor (R) 488，Alexa Fluor (R) 555，37℃孵育 40 min，Hochest 33342 染核，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照，

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)中僅次于腦血管疾病的第二 大病種，大部分可以用藥物控制，30% 癲癇患者 會(huì)發(fā)展為難治性癲癇，其中顳葉癲癇占很大部分。 顳葉癲癇常見(jiàn)的病理學(xué)改變是海馬硬化、萎縮、 海馬特定部位神經(jīng)元丟失，膠質(zhì)細(xì)胞增生 [7]。苔蘚 纖維出芽是人類顳葉癲癇的典型病理特征，苔蘚 纖維是齒狀回顆粒細(xì)胞的軸突，正常情況下苔蘚 纖維是同海馬 Hilus 區(qū)和 CA3 區(qū)錐體細(xì)胞的樹(shù)突建 立聯(lián)系，在海人酸誘導(dǎo)損傷的情況下，Hilus 區(qū)神 經(jīng)元和 CA3 區(qū)神經(jīng)元顯著丟失，苔蘚纖維與靶細(xì) 胞失去聯(lián)系，觸發(fā)苔蘚纖維異常出芽與自身胞體 和樹(shù)突形成自身反饋的興奮性突觸，另外內(nèi)分子 層的傳入纖維起始于 Hilus 區(qū)神經(jīng)元，Hilus 區(qū)神 經(jīng)元的丟失使苔蘚狀纖維發(fā)芽構(gòu)成新的傳入通路， 形成異常的自反饋，在癲癇反復(fù)發(fā)作中起到重要 作用 [8-10]，海馬 Hilus 區(qū)在癲癇的發(fā)作中也起著重 要作用。本研究采用海人酸誘導(dǎo)的顳葉癲癇小鼠 模型，重點(diǎn)觀察小鼠海馬 Hilus 區(qū)的病理變化。

瘦素是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌并釋放入血 的多肽類激素，其可通過(guò)血腦屏障作用于中樞神 經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)能量代謝 [11]。近年絕大部分研究表明， 瘦素具有減輕神經(jīng)損傷的作用，如在腦缺血、阿 爾茨海默病、帕金森病，谷氨酸誘導(dǎo)的癲癇中均 有保護(hù)作用 [12-14]。少量研究表明，高瘦素水平對(duì) 癲癇的發(fā)生具有促進(jìn)作用 [15]，但是具體原因還不 清楚。根據(jù) Lynch 等 [15] 的研究，本文章探討腹腔 注射 (10mg/kg) 瘦素在海人酸誘導(dǎo)的顳葉癲癇模型 中的作用以及可能的潛在機(jī)制。

本研究觀察了 Hilus 區(qū)的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì) 胞在顳葉癲癇小鼠海馬損傷中的變化。在海人酸 誘導(dǎo)顳葉癲癇基礎(chǔ)上，瘦素預(yù)處理后小鼠的癲癇 行為評(píng)分增加，病理顯示海馬 Hilus 區(qū)神經(jīng)元丟失 加重，可能是由于小鼠海馬內(nèi)凋亡蛋白 Bax 表達(dá) 顯著升高，導(dǎo)致神經(jīng)元抗凋亡能力下降。神經(jīng)元 和膠質(zhì)細(xì)胞是人腦的主要構(gòu)成組分，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù) 量是神經(jīng)元的 5 ~ 10 倍，其中數(shù)量最多的是星形 膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞平鋪并緊緊包裹著神經(jīng) 元和血管，長(zhǎng)期以來(lái)星形膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為主要對(duì) 神經(jīng)元起營(yíng)養(yǎng)和支持作用，對(duì)維持神經(jīng)元外的微 環(huán)境起著至關(guān)作用 [16]。星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化與病 理刺激的嚴(yán)重程度相關(guān)，神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，在活化的星形膠質(zhì) 細(xì)胞中顯著增加，常用來(lái)鑒別大腦損傷區(qū)與非損 傷區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞 [17]。在神經(jīng)元丟失后，星形 膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化既可以起到填充的作用，也可 將損失部位隔離，但過(guò)度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞形 成的瘢痕、星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸合成酶含量降 低也是癲癇反復(fù)發(fā)作及難以治愈的重要因素 [18-19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，瘦素預(yù)處理后，顳葉癲癇小鼠海馬 Hilus 區(qū) GFAP 表達(dá)增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化， 呈現(xiàn)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)主要表現(xiàn)為細(xì)胞增 生和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，包括胞體肥大變粗、突 起增加、延長(zhǎng)、聚集成簇。外源性給予一定量的 瘦素會(huì)加重海人酸誘導(dǎo)的病理?yè)p傷，其可能原因 是降低神經(jīng)元的抗凋亡能力，過(guò)度激活星形膠質(zhì) 細(xì)胞。瘦素可能作為研究顳葉癲癇的新的切入點(diǎn)。