15版藥典中藥材黃曲霉毒素檢測(cè)方案

                        免疫親和柱---光化學(xué)柱后衍生法

本法系用高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計(jì)），除另有規(guī)定外，按下列方法測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑

流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）

光化學(xué)柱后衍生器（254nm. PriboFast-KRC光化學(xué)柱后衍生器.Pribolab-MDU光化學(xué)柱后衍生器）

熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)：360nm(365nm)   發(fā)射波長(zhǎng)：450nm

兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。

混合對(duì)照品溶液的制備

精密量取PriboFast®STD#1082AFT黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1.0µg/mL、 0.3µg/ mL、1.0µg/ mL、0.3µg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

供試品溶液的制備

1.取供試品粉末約15g(過二號(hào)篩)，精密稱定，加入氯化鈉3g，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11,000轉(zhuǎn)/分,普瑞邦均質(zhì)器Pribolab® WR800: 轉(zhuǎn)速22,000 r/min）。

2.2500r/min離心5分鐘或用槽紋濾紙過濾。

3.精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用PBS溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm,用PriboFast®玻璃微纖維濾紙代替最好，性能較高，效率高）過濾。

4.準(zhǔn)確移取20.0mL樣品提取液，過PriboFast® 免疫親和柱，過柱時(shí)流速不能快，流速快的話回收效率差，建議采取重力過柱。

5.用PBS溶液20mL洗滌，洗滌液棄去。

6.為保證洗脫充分，建議以2.0mL色譜甲醇分三步進(jìn)行洗脫，重力洗脫即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脫，當(dāng)溶劑通過柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇進(jìn)行洗脫，過柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脫，過柱前孵育30s，并使2-3mL空氣通過柱體，收集洗脫液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。 (免疫親和柱操作建議使用PriboFast®泵流操作架,便于控制各個(gè)步驟流速,保證較好的回收率)

液相色譜條件（光化學(xué)柱后衍生法）

流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）

柱  溫：30 ℃

進(jìn)樣量：20 μL

激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：450 nm

用PriboFast®KRC光化學(xué)柱后衍生器(254nm)

流速：  0.8 mL/min    

保留時(shí)間:G2: 10 min, G1:12 min, B2:14 min, B1:18min（大約)

用PriboFast®MDU光化學(xué)柱后衍生器(254nm)

流速：    1.2 mL/min    

保留時(shí)間：G2: 3 min, G1:5 min, B2:6 min, B1:9 min（大約)

測(cè)定法： 分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密吸取上述供試品溶液20～25μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計(jì)算，即得。

【附注】

（1）本實(shí)驗(yàn)應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護(hù)措施，并不得污染環(huán)境。

（2）殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應(yīng)置于專用貯存容器（裝有10%次氯酸鈉溶液）內(nèi)，浸泡24小時(shí)以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。