雙色同步成像在熒光共定位等成像實驗中的應(yīng)用
熒光的共定位是當今生物顯微成像中一個極為常見的技術(shù)，兩個或者更多種不同顏色的熒光探針被用來標記不同的結(jié)構(gòu)/位點，使得其相互關(guān)系得以明晰地在合并的圖像上展現(xiàn)。隨著研究者對于實驗的要求越來越高，這些熒光共定位的成像逐漸被希望能用于熒光強度高速變化或者樣品本身位置不斷變化的實驗中，比如活動的斑馬魚、線蟲體內(nèi)兩類神經(jīng)細胞的熒光共定位成像。在這些實驗中，由于樣品本身是運動的，兩個顏色的成像時間間隔越短，越能夠反映熒光探針共定位的真實情況。
在另外一些實驗中，同一個熒光探針的熒光顏色(波長)會隨著環(huán)境的變化而發(fā)生變化，那么前后兩種顏色熒光強度的比值就能反映出環(huán)境的變化，如Di4之于細胞膜電位，Cameleon之于Ca離子濃度等等。當相關(guān)的環(huán)境變化速度比較快的時候，兩個顏色的成像時間間隔越短，測量也就越精確。
綜合以上兩類成像實驗，均是需要盡可能地將兩個不同顏色熒光信號在同一時刻拍攝下來，那么最理想的情況就是我們在這篇Application notes中所提到的雙色同步成像，即完全同時地拍攝兩個顏色通道的熒光信號。
雙色同步成像——采用W-View GEMINI的完全同步成像
雙色同步成像最直接的思路就是用彩色相機，但如今絕大多數(shù)的彩色相機是在黑白芯片的基礎(chǔ)上將每個像素前添加濾光涂層（一般為紅、綠、藍三種，如下圖），此彩色濾光涂層使得不同的像素可以分別得到不同的顏色信息，最后合成出彩色的圖片。這樣的設(shè)計在明場成像（如HE染色，免疫組化切片）中不可或缺，但對于生物熒光信號的成像卻是有缺陷的。首先，濾光涂層的出現(xiàn)會吸收或反射部分入射光信號，降低整個芯片的靈敏度，在信號本來就較弱的熒光拍攝中會影響到成像信噪比；其次，由于不同像素前存在不同顏色的濾光涂層，對于單色光信號——比如熒光信號——的實際分辨率將被降低。換句話說，對于一臺140萬像素的彩色CCD相機，其真正能夠檢測到綠色熒光信號的像素僅有約70萬個像素，其余的70萬像素的綠光強度信息均為計算獲得（注：因為綠色為人眼最為敏感的顏色，所以一般彩色相機中以4個像素為一組，兩個像素采用綠色涂層，其余兩個像素則分別采用藍色及紅色涂層）。更重要的，如果采用這類彩色相機用于雙色熒光同步成像，一些顏色并不是紅綠藍三種顏色（對應(yīng)彩色相機像素上的三種濾光涂層）的熒光探針將受到極大的限制。
所以傳統(tǒng)上，許多實驗室通過切換顯微鏡上的濾光塊轉(zhuǎn)盤或者是采用濾光輪進行不同顏色之間的切換。但這樣無法做到完全同步拍攝兩個顏色的圖片，濾光塊轉(zhuǎn)盤的切換時間需要約1秒鐘，而濾光輪不同濾光片之間的每一次切換也需要幾十毫秒時間，事實上影響了實驗的時間分辨率，所以在比較高速的比例成像等場合，采用濾光輪或者濾光塊轉(zhuǎn)盤都容易造成數(shù)據(jù)的誤差（舉例計算請參考下面所示的“應(yīng)用實例1”）。
而采用濱松W-View GEMINI則完全沒有這樣的擔心，兩個顏色的信號被成像到相機的上下兩半感光芯片上，實現(xiàn)了兩個顏色成像的完全同步。
雙色同步成像——一臺Flash 4.0 LT相機作兩臺用
采用W-View GEMINI這樣的雙色分光附件將兩種顏色的信號成像到一臺相機的一個感光芯片上很好地解決了同步成像的時間問題，但對于絕大多數(shù)的相機，整個感光芯片只能設(shè)置一個曝光時間，當兩個顏色的信號強度相差較大時將很難同時將兩個顏色的成像信噪比保證在最佳狀態(tài)。
而濱松Flash 4.0 LT則可以分別調(diào)整同一芯片上下兩半的曝光時間。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0 LT的時候，我們可以非常靈活地調(diào)整兩個顏色信號的相對亮度，得到更加能夠突出所需信號和結(jié)構(gòu)的圖片。在兩個顏色通道的信號差別非常大的時候，Flash 4.0 LT + W-View GEMINI這種靈活的曝光時間設(shè)置就可以針對不同的波長設(shè)置不同的曝光時間，同時保證兩個波長信號的信噪比。
W-View GEMINI應(yīng)用實例1——表達Cameleon (YC3.60)的HeLa細胞在收到組胺刺激時的高速鈣離子成像
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物鏡：100x，NA 1.49 |
幀速：33.3 幀/秒 |
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相機：濱松ImageEM X2 EMCCD |
曝光時間：30 ms |
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附件：濱松W-View GEMINI |
增益：1200x |
在細胞內(nèi)鈣離子濃度高速變化的場合下，雙色同步成像可以保證數(shù)據(jù)的高速采集。以這個實驗為例，YC3.60的分子中包含CFP、YFP兩個部分，沒有鈣離子結(jié)合時，兩個部分距離較遠，用430nm的光激發(fā)時得到的是CFP所發(fā)射的480nm的青色信號；當結(jié)合了鈣離子之后，YC3.60中CFP和YFP兩個部分在分子中會挨到一塊兒，符合CFP-YPF發(fā)生FRET的條件，430nm激發(fā)光照射時，能量將由CFP轉(zhuǎn)移至YFP，發(fā)射出535nm的黃色熒光信號。所以通過實時檢測480nm和535nm的信號強度比值就可以監(jiān)測細胞內(nèi)鈣離子的濃度。
如果采用濾光輪，假設(shè)不同濾光片位置的切換時間為30ms（這已經(jīng)是比較出色的產(chǎn)品了），CFP和YFP各自需要30ms曝光時間，一個數(shù)據(jù)點需要切換兩次濾光片位置（如從CFP切換到YFP然后還得切換回來預(yù)備下一個數(shù)據(jù)點的采像），所以總共需要120ms來采集一個數(shù)據(jù)點，結(jié)果就是當我們采用濾光輪的配置時每秒鐘我們只能得到8-9個數(shù)據(jù)點（鈣離子濃度數(shù)據(jù)）。
而采用W-View GEMINI時，30ms的曝光時間內(nèi)就可以同時采集到CFP和YFP的熒光信號，而且沒有顏色切換的時間損失，最終保證了33幀/秒的高速成像，也就是說，每秒鐘我們可以得到33個鈣離子濃度數(shù)據(jù)點。
兩種方法在動力學上的表現(xiàn)高下立判。
W-View GEMINI應(yīng)用實例2——采用Di-4-ANEPPS對hiPS-心肌細胞的膜電位變化進行成像
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物鏡：100x，NA 1.49 |
幀速：100 幀/秒 |
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相機：濱松Flash 4.0 V2 sCMOS |
曝光時間：10 ms |
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附件：濱松W-View GEMINI |
發(fā)射波長：525/50 nm & 630/92 nm |
對于樣品有位置移動的情況下，雙色同步成像可以抵消樣品位置變化所造成的誤差。
比如這個例子中的誘導心肌細胞，我們需要通過Di-4-ANEPPS這個染料對其膜動作電位進行成像。Di-4-ANEPPS這種熒光染料通過藍光（~488nm）激發(fā)，其發(fā)射波長卻會根據(jù)膜電位而有所變化，通過計算細胞不同區(qū)域內(nèi)525nm/630nm的比值就可以得到此區(qū)域內(nèi)膜電位的變化。這種成像方法相相對膜片鉗等電生理方法而言，可以得到細胞任意位置的膜電位變化，空間分辨率更高。而W-View GEMINI雙色分光附件以及高速高靈敏度的Flash 4.0 sCMOS相機的應(yīng)用也保證了其極高的時間分辨率（每秒100個數(shù)據(jù)點），使得我們可以對細胞任意位置的動作電位進行時間空間都非常精確的測量。
W-View GEMINI應(yīng)用實例3——線蟲鹽敏感（salt-sensing）神經(jīng)元在NaCl濃度變化時響應(yīng)的時空關(guān)系分析
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物鏡：60x，oil |
幀速：30 幀/秒 |
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相機：濱松Flash 4.0 LT |
曝光時間：33 ms |
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附件：濱松W-View GEMINI |
探針：ASER-R-GECO1_AIY-G-GECO1.2 |
在這個例子中，為了監(jiān)測ASER和AIY兩個神經(jīng)元在外界NaCl濃度變化時的表現(xiàn)，研究者分別在兩個神經(jīng)元上表達標記了紅色和綠色的鈣離子敏感熒光蛋白R-GECO1與G-GECO1.2，然后讓環(huán)境中的NaCl濃度以10秒為周期在0mM和50mM之間切換。通過分析兩個神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的濃度變化，可以看出兩個神經(jīng)細胞兩者在NaCl不同濃度下的相反表現(xiàn)。
擴展閱讀：GCaMP鈣離子成像中，視網(wǎng)膜上兩個神經(jīng)細胞表現(xiàn)出相反的鈣離子濃度變化（A濃度高的時候B濃度低，B濃度變高時A濃度下降），如何采用Reslice方法在平面圖中反映出這種關(guān)系，敬請參閱鏈接中文章第14-16步：點擊進入了解>>
W-View GEMINI應(yīng)用實例4——心肌細胞搏動時鈣離子濃度的變化與細胞收縮在時間上的先后分析
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相機：濱松Flash 4.0 V2 |
物鏡：40x，NA 0.6 |
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附件：濱松W-View GEMINI |
曝光時間：30 ms |
除了兩個不同顏色的熒光同步成像之外，W-View GEMINI還可以用于熒光和明場的同步成像。在這個例子中，研究者同步拍攝監(jiān)測了心肌細胞波動時的鈣離子濃度變化以及細胞收縮的情況。藍光激發(fā)發(fā)綠色熒光的Fluo-8被用于鈣離子濃度的監(jiān)測，而明場的相差（phase contrast）成像則是采用了600-680nm的紅光。通過對單個細胞中鈣離子濃度和相差圖像的分析，可以看出鈣離子的濃度上升是稍稍領(lǐng)先于心肌細胞的收縮的。
這一類實驗中，明場透射光的信號是比熒光信號強很多的，除了可以在明場透射光光路中加入減光片將兩個信號調(diào)整得差不多之外，更方便的方法是利用Flash 4.0 LT可以針對芯片兩半分別調(diào)整曝光時間的特點進行更加靈活的調(diào)整（參考本文相關(guān)段落：雙色同步成像——一臺Flash 4.0 LT相機作兩臺用）。
W-View GEMINI應(yīng)用實例5——斑馬魚雙色雙光子lightsheet成像
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相機：濱松Flash 4.0 V2 |
附件：濱松W-View GEMINI |
在國內(nèi)，北京大學的研究者也采用W-View GEMINI在他們自己設(shè)計搭建的雙色雙光子lightsheet成像系統(tǒng)中。系統(tǒng)采用兩臺飛秒激光器作為光源分別雙光子激發(fā)兩個顏色的熒光探針，進行雙色的3維lightsheet成像。樣品是3天大小的斑馬魚，紅色和綠色的熒光探針分別標記著紅細胞和胰島細胞，為了能夠盡可能縮短3維圖像的采集時間，以防紅細胞在血管中的移動影響成像質(zhì)量，系統(tǒng)中采用了W-View GEMINI進行了雙色的分光，讓Flash 4.0 V2相機同步對紅細胞和胰島細胞進行成像。
http://v.youku.com/v_show/id_XMTI3NjQzMjA1Mg==.html
更多雙色同步成像的文獻與應(yīng)用實例
1. 單分子多色FRET，采用濱松Flash 4.0 & W-View GEMINI，通過cy3/cy5/cy7的組合分析核糖體與tRNA的相互作用：
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-10°/-30°深制冷且>70%QE的 高速高靈敏度sCMOS |
>70%QE的 高速高靈敏度sCMOS |
業(yè)界幀速最高（70fps @ 512x512）的背照式EMCCD |
雙色分光附件 |
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