常溫才是常道：生物樣品的常溫保存
摘要：
高質(zhì)量的生物樣品是組學(xué)研究和個(gè)性化醫(yī)療過程中臨床檢驗(yàn)順利實(shí)施的前提。生物樣品的保存方式關(guān)系到待檢樣品的質(zhì)量和檢測的結(jié)果。樣品的適當(dāng)?shù)奶幚怼⒈４娣绞绞亲罱K獲取準(zhǔn)確測定結(jié)果必不可少的一環(huán)。常溫保存能耗少，環(huán)保，效費(fèi)比較高，是一種有潛力的生物樣品保存方式。
正文：
生命科學(xué)領(lǐng)域高通量技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了諸如基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及代謝組等各類組學(xué)的研究。相應(yīng)地，為了客觀、全面、完整地反映核酸、蛋白、代謝分子等研究對(duì)象各自的量以及彼此之間的相互關(guān)系，獲得高質(zhì)量的生物樣品是非常必要的。高質(zhì)量的生物樣品是組學(xué)研究和個(gè)性化醫(yī)療過程中臨床檢驗(yàn)順利實(shí)施的前提。上海伯豪生物在多年提供組學(xué)研究技術(shù)服務(wù)的過程中，常常遇到樣品質(zhì)檢不過關(guān)的事例。不適當(dāng)?shù)臉悠诽幚�、保存和管理方式帶來的結(jié)果有時(shí)是災(zāi)難性的。對(duì)生物樣品的精準(zhǔn)采集、正確標(biāo)記很重要。除此之外，樣品的適當(dāng)?shù)奶幚�、保存方式也是最終獲取準(zhǔn)確測定結(jié)果必不可少的一環(huán)。
談起生物樣品的保存，人們往往聯(lián)想到低溫。但生物樣品在常溫下，通過采取適當(dāng)?shù)姆绞�，也是可以保存較長時(shí)間的。常溫保存能耗少，環(huán)保，效費(fèi)比較高，是一種有潛力的生物樣品保存方式。本文主要談?wù)勆飿悠返某乇４妗?/FONT>
一、 生物樣品常溫保存的幾種方式
目前生物樣品的常溫保存主要有以下四種方式。
1．福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin embedded, FFPE）是對(duì)動(dòng)物組織及其所包含的生物大分子進(jìn)行常溫保存的較常用的方法。福爾馬林的有效成分甲醛含有羰基基團(tuán)，極性較強(qiáng)，化學(xué)與生物學(xué)活性強(qiáng)。它可使生物大分子發(fā)生交聯(lián)，加上后續(xù)的脫水步驟，整個(gè)過程破壞了引起核酸和蛋白等大分子降解的酶類的活性，因而被包埋的組織可以在常溫下保存。FFPE處理的樣品組織與細(xì)胞的形態(tài)學(xué)保持效果很好，多用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的組織病理學(xué)診斷和免疫組織化學(xué)檢測。在研究中也用于顯色原位雜交或熒光原位雜交。 FFPE包塊在常溫下可長時(shí)間保存，有的數(shù)十年后仍有使用價(jià)值。用這種方法保存核酸，得率不高，且片段化和交聯(lián)現(xiàn)象較嚴(yán)重。收獲的DNA一般長度不多于400bp，RNA長度不多于200bp。但也能滿足某些PCR、RT PCR或基因芯片雜交的要求。
由于福爾馬林有致癌性，且容易使核酸片段化，人們開發(fā)出一些福爾馬林替代物用于組織的固定。經(jīng)這些替代物固定后石蠟包埋的組織，收獲的核酸長度可達(dá)數(shù)千bp。
2．用穩(wěn)定液對(duì)組織及核酸進(jìn)行常溫保存。這是一種簡便易行的生物樣品處理和保存方式，特別適用于動(dòng)物組織樣品的短期處置。一些硫酸鹽類，在由緩沖劑調(diào)節(jié)的適當(dāng)?shù)膒H值范圍內(nèi)，可使某些核酸酶活性降低或喪失，從而保護(hù)大分子不被降解。這類穩(wěn)定液，可以迅速滲透組織和細(xì)胞，抑制核酸酶活性。將切下來的組織迅速切成尺寸不大于0.5cm的小塊，沒入5-10倍的穩(wěn)定液中。對(duì)于RNA來說，樣品可置于室溫（25℃）保存一周，4℃保存一月，-20℃長期保存。當(dāng)需要分離核酸時(shí)，將組織從穩(wěn)定液中取出，按常規(guī)進(jìn)行后續(xù)操作即可。上海伯豪生物技術(shù)有限公司開發(fā)出的RNAsafetyTM組織RNA保存液，可用于這種類型的保存。實(shí)驗(yàn)顯示，它對(duì)組織中RNA的保護(hù)效果明顯（見圖1 ）。采用RNAsafetyTM這類穩(wěn)定液，無需采用液氮或干冰轉(zhuǎn)送和運(yùn)輸組織，便于操作，也節(jié)省材料費(fèi)和運(yùn)輸費(fèi)。是值得采用的一種樣品處理和保存方式。
圖1. 用上海伯豪的RNAsafetyTM組織保存液保存大鼠肝臟組織（藍(lán)、紅、綠表示三個(gè)復(fù)本）。室溫放置兩周時(shí)，指示RNA完整性的RIN值仍在合格線（紅線）以上。
3． 采用干式化學(xué)穩(wěn)定基質(zhì)（包括高分子基質(zhì)）也可以保存核酸。FTA （Flinders Technology Associates）濾紙保存是其中的一種方式。FTA濾紙是一種多孔的纖維素基質(zhì)，經(jīng)由尿酸、非離子表面活性劑或強(qiáng)力變性劑以及螯合劑浸泡處理。當(dāng)樣品加到濾紙上時(shí)，細(xì)胞被裂解，核酸被釋放出來，吸附在濾紙上。濾紙上的化學(xué)物質(zhì)可使蛋白變性，酶活性喪失。載有核酸的FTA濾紙經(jīng)干燥，可以常溫保存核酸長達(dá)數(shù)年。目前FTA濾紙只可用于常溫保存DNA。
還有其它形式的干式保存基質(zhì)。它們由專利配方的、不同的化學(xué)物質(zhì)組合而成，可提供一種微環(huán)境，保護(hù)核酸不被氧化、水解或酶解，或者將核酸與熱源、紫外線隔離。這類基質(zhì)通常置于微孔板孔內(nèi)或試管內(nèi)。適量加入已抽提純化好的核酸樣品，樣品吸附在基質(zhì)上，干燥后可常溫保存。這種方法，只可分別保存DNA 或RNA，不宜將二者同時(shí)保存。椐推算，這類基質(zhì)可將核酸保存十多年。
4．將生物樣品冷凍干燥然后進(jìn)行常溫保存。水分是降解酶類作用的條件之一。凍干可去除樣品中的水分，因而抑制酶的作用。凍干機(jī)通過制冷功能將樣品細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的水凍成冰，通過抽真空和升溫將冰升華，進(jìn)一步提高溫度除去殘留的與組織或細(xì)胞結(jié)合的水分子。為了防止凍干品再次吸收空氣中的水分，可以將凍干后的樣品真空包裝，然后常溫保存。這樣也可抑制樣品的氧化和微生物的生長。核酸和蛋白樣品凍干后可保存1-4年。凍干RNA通常保存不超過一年。
二、 生物樣品常溫保存的優(yōu)勢
相比低溫保存，對(duì)生物樣品進(jìn)行常溫保存有一些明顯的優(yōu)勢。首先是費(fèi)用方面比較合算。樣品保存用的超低溫、深低溫冰箱的購置、維護(hù)保養(yǎng)和折舊費(fèi)用往往相當(dāng)可觀。如果多個(gè)冰箱集中放置，還需要專用的空調(diào)房間來放置這些冰箱。為了防止供電故障或冰箱故障導(dǎo)致樣品被破壞，還需要備用發(fā)電設(shè)備或備用供電線路，以及備用干冰等物料。此外還可能需要配置溫度監(jiān)控和報(bào)警設(shè)備。如果用液氮保存，液氮罐的購置、液氮的補(bǔ)充也會(huì)產(chǎn)生不菲的費(fèi)用。有人估計(jì)，一份腫瘤樣品，凍干保存一年的成本是3歐元，-80℃ 保存的成本是24歐元，液氮保存的成本是31歐元。低溫保存的樣品往往采用干冰運(yùn)輸，干冰本身的購置費(fèi)用以及干冰帶來的運(yùn)輸重量增加也加大了成本。使用液氮還要顧及到安全問題。大的液氮罐屬于壓力容器，需要正確處置；液氮溫度極低（-196℃），操作失誤時(shí)可致凍傷。另一方面，使用冰箱對(duì)環(huán)境的影響也比較大。溫度越低，每年所需的二氧化碳的排放量越大。一般家用冰箱年需二氧化碳的排放量約為1700磅，-80℃冰箱為4000磅，而-150℃ 深低溫冰箱為15,000磅。
常溫保存對(duì)空間的利用效率比較高。低溫保存設(shè)備由于一些制冷、隔熱等部件的存在，有效的冷凍空間在整個(gè)設(shè)備所占空間的比例有時(shí)并不高；為了使冰箱正常制冷，冰箱之間需要有足夠的距離，以便排熱；為了方便取樣，液氮罐也不能做得太高。這些因素，都限制了低溫設(shè)備的空間利用效率，也加大了低溫保存的成本。樣品進(jìn)行常溫保存時(shí)，不存在低溫部件對(duì)空間的占用，人們可以充分地對(duì)儲(chǔ)存空間進(jìn)行合理調(diào)配與利用。
三、生物樣品的常溫保存是今后的發(fā)展方向
生物樣品常溫保存的推廣，目前受到一些客觀因素的限制。FFPE方法采用的福爾馬林，有致癌性，一些人望而生畏，不愿意采用這種方法，而且這種方法有些繁瑣。采用福爾馬林的安全替代物進(jìn)行固定，會(huì)增加一些費(fèi)用，在臨床認(rèn)可上也存在著與現(xiàn)有條規(guī)不相適應(yīng)之處。而且，早期采用替代物固定的組織學(xué)效果相比用福爾馬林稍差一些。 隨著新一代測序等技術(shù)的發(fā)展，對(duì)核酸質(zhì)量的要求更為重要， 因此，盡管組織學(xué)固定效果的不盡理想，但由這些替代物固定的樣品可以提取出更高質(zhì)量的核酸（片段化程度較低）。它們的價(jià)值將會(huì)逐漸顯現(xiàn)的。更理想的、新型的福爾馬林的替代物需要進(jìn)一步開發(fā)。
上述的幾種常溫保存方式，在保存生物樣品時(shí)，有些方面做不到兼顧。例如，F(xiàn)FPE樣品的酶活性受到了破壞；液態(tài)穩(wěn)定液對(duì)組織的常溫保存時(shí)間仍不夠長（通常一周）；干式化學(xué)穩(wěn)定基質(zhì)只能分別保存DNA或RNA，不能保存組織；凍干法可以保持組織的酶活性以及形態(tài)學(xué)特征，但對(duì)核酸（尤其是RNA）的保存時(shí)間不是太長（RNA保存不超過一年）。因此，需要根據(jù)取樣的目的，再?zèng)Q定采用哪種保存方式最合理。特別需要指出的是，組織穩(wěn)定液，例如上海伯豪生物技術(shù)有限公司開發(fā)出的RNAsafetyTM組織保存液，也可用于冰箱發(fā)生故障時(shí)生物組織樣品的應(yīng)急保存。
隨著諸多現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測手段的應(yīng)用和個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展，基礎(chǔ)研究和臨床檢驗(yàn)所收集的生物樣品的數(shù)量將是巨大的。對(duì)它們長期進(jìn)行低溫保存將耗費(fèi)不少資源和環(huán)境成本。開發(fā)出低成本的、符合組織學(xué)和現(xiàn)代遺傳學(xué)檢測要求的、可長期保存樣品的常溫保存方發(fā)將帶來巨大的效益。生物樣品的常溫保存將是今后的發(fā)展方向，因?yàn)檫@種方式節(jié)儉、環(huán)保。
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