藥物誘導(dǎo)的hERG (human ether-a go-go-related gene) 離子通道被阻斷可能導(dǎo)致嚴重的致死性室性心律失�！�—尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速（torsade de pointes, TdP）。近年來，一批FDA 已批準藥物由于其對hERG 的脫靶效應(yīng)而被迫從市場上撤出。由此，愈發(fā)凸顯了在藥物研發(fā)早期階段開展候選藥物hERG 安全性篩選的重要性和快速增長的需求。本文重點闡述了一種新型鉀離子通道檢測試劑盒在FLIPRTETRA 高通量實時熒光成像分析系統(tǒng)上對hERG 陽性化合物的效應(yīng)進行了評估和檢測。實驗根據(jù)鉀離子(K+)通道對鉈離子(Tl+)的通透性，采用了對鉈離子敏感的熒光染料作為指示劑。實驗對幾種常見的hERG 陽性抑制劑的藥理效應(yīng)進行了檢測，結(jié)果與IonWorks Barracuda® Plus 全自動膜片鉗系統(tǒng)得到的數(shù)值作比較。

 

FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒（圖1）含有鉈離子敏感的指示染料。在開始染料加載步驟中，含有乙酰氧基甲（AM）酯的鉈離子指示染料通過被動擴散方式穿過細胞膜進入細胞內(nèi)部。細胞質(zhì)酯酶剪切掉乙酰氧基甲（AM）酯并釋放出其激活的熒光形態(tài)。另外，在細胞外采用了專利的屏蔽染料技術(shù)從而降低了背景熒光信號的干擾�？赏ㄟ^向細胞溶液中加入混合的K⁺和Tl⁺或包含了Tl⁺的配體來激活鉀離子通道。熒光信號的增強表明了鉈離子特異性地通過鉀通道進入細胞內(nèi)，從而對鉀通道活性進行了功能性檢測。

 

 

FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒(Molecular Devices cat. #R8222) 含有Tl⁺敏感染料、屏蔽染料、200 mM K₂SO₄、50 mM Tl₂SO₄、5X 不含氯離子的緩沖液以及HBSS + 20 mM HEPES 緩沖溶液。每個包裝的試劑盒可以完成10 塊96，384，或1536 孔板。實驗檢測流程見圖2。

 

 

 

疏水性化合物由于非特異性結(jié)合到化合物板等實驗耗材中，會影響到其顯著的效能值。在本實驗中，化合物首先在100%DMSO 中被稀釋，然后在實驗前立即轉(zhuǎn)移到含HBSS+ 20 mM HEPES 緩沖溶液的玻璃襯里的多孔板中。

 

細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人Kv11.1（hERG）離子通道的中國倉鼠卵巢（CHO）由ChanTest 公司（Cleveland, OH）提供。實驗開始2 天前在黑壁底透的384 孔板中按照每孔6500 個細胞的密度種植細胞，培養(yǎng)基中包含了篩選抗生素并在37℃和 5% CO₂ 條件下培養(yǎng)。實驗前24 小時生長培養(yǎng)基更換為含四環(huán)素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。實驗前4 小時細胞從37℃轉(zhuǎn)移至 28℃條件下培養(yǎng)以增加hERG 通道的表達。然后細胞板加入染料在室溫下避光孵育一小時。

 

為進行藥理學(xué)特性分析，先加入hERG通道阻斷劑并在室溫下孵育30 分鐘。FLIPR^Tetra 系統(tǒng)在實驗檢測過程中向每個孔中加入之前優(yōu)化好的緩沖液。系統(tǒng)采用了470-495nm 的LED 激發(fā)光源和515-575nm 的發(fā)射濾片。為進行對比，使用FluxOR 試劑盒（Life Technologies）進行了平行實驗。依照生產(chǎn)廠家提供的方案進行操作。數(shù)據(jù)采樣間隔為1 秒并持續(xù)140 秒。結(jié)果導(dǎo)出到GraphPad Prism 軟件進行分析。

 

實驗方案開發(fā)中首先取決于刺激hERG通道所需鉈離子和鉀離子濃度的優(yōu)化。多孔板中放置多種濃度的K₂SO₄ 和Tl₂SO₄ 緩沖液。Tl⁺ 和 K⁺緩沖液用1倍濃度的不含氯離子的緩沖溶液稀釋。由于每摩爾硫酸鉈和硫酸鉀含有2 份的陽離子，因而被看作為兩倍的濃度進行處理。FLIPR^Tetra 系統(tǒng)在實驗檢測過程中向每個孔中加入刺激緩沖液。不同濃度誘發(fā)的信號曲線進行比較以確定最大信號對應(yīng)的最優(yōu)濃度值。結(jié)果顯示，產(chǎn)生最大hERG 信號的最優(yōu)Tl⁺ 和 K⁺濃度分別是1mM 和10mM（圖3）。

 

 

 

為便于結(jié)果比較，所有同樣的hERG 通道阻斷劑均在IonWorks Barracuda1 全自動膜片鉗系統(tǒng)進行了檢測得到相應(yīng)的IC₅₀ 值（圖4）。為觀察化合物的頻率依賴性效應(yīng)，電壓刺激命令均以0.1Hz 頻率在加樣前后分別刺激5 次。第五個電流信號記錄的sweep 中hERG 尾電流峰值被用來測定化合物效應(yīng)。

 

 

 

應(yīng)用FLIPR鉀通道檢測試劑盒對七個已知的hERG 阻斷劑的效應(yīng)進行評估。量效反應(yīng)曲線見圖5。IC₅₀ 值與IonWorks Barracuda 全自動膜片鉗系統(tǒng)檢測的IC₅₀的比較見表1 兩者具有很好的相關(guān)性。

 

 

另外，其中3 個化合物被用于評估比較另一種基于鉈離子的試劑盒——FluxOR 鉀離子通道試劑盒（圖6）。兩者所得到的IC₅₀ 值很接近，具體見表2。然而，F(xiàn)LIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的信號窗口是的2.25（基于信號與基線的比例），這一數(shù)值顯著高于FluxOR（信號窗口是0.5）。表明了FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的實驗結(jié)果更精確、更可靠。陰性對照是4μM 特非那定對hERG通道的阻斷效應(yīng)，陽性對照是刺激性緩沖液對hERG 通道的效應(yīng)。更低的空間差異和更大的信號窗口產(chǎn)生了更大的Z因子值，見圖7。這可能源于FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒是真正的均相實驗體系且是免洗的或無需更換培養(yǎng)基，從而顯著減小了孔間差異性。

 

 

 

 

 

FLIPR鉀離子通道檢測試劑盒 采用均相 免洗 的實驗方案檢測鉀離子通道功能活性。 在本文中，我們應(yīng)用 了 hERG通道陽性抑制劑驗證了 FLIPR鉀離子通道檢測試劑盒和電生理方法得到的結(jié)果是高度相關(guān)。

 

在另個單獨運行的實驗中， 相比于其它同類型試劑盒來說， FLIPR鉀離子通道檢測試劑盒 表現(xiàn)出了顯著性更高的 信號窗口以及Z因子值。 明顯提升的實驗 結(jié)果表現(xiàn) ，結(jié)合 FLIPR^Tetra系統(tǒng)的高通量性能，在 藥物研發(fā)早期階段將為究者提供一種強大的 hERG風(fēng)險評估分析平臺。