· 可重復(fù)性表型檢測

· 既高通量又不犧牲質(zhì)量的圖像獲取

· 應(yīng)用交互式預(yù)覽，大大減少分析設(shè)置時間

· 統(tǒng)一的統(tǒng)計方法使結(jié)果更準(zhǔn)確

 

 

躁郁癥（BD）是一種高度遺傳性的心理疾病，它影響到全球大概1%的人口。1949 年鋰被第一次應(yīng)用于躁郁癥，到目前為止鋰仍是治療BD 的主要藥物。然而在一半的病例中，鋰并不能起到很好的治療效果，同時此藥的毒性和副作用也值得關(guān)注。

 

目前為止人們對于鋰的治療機制還未完全了解，已知鋰會阻斷糖原合成酶激酶3 (GSK-3)的活性并激活Wnt 信號通路，后者直接或者間接地減少蛋白酶對b-catenin 的降解。我們可以利用Wnt/b-catenin 信號通路中新的蛋白以及藥理學(xué)調(diào)節(jié)分子對b-catenin 的阻斷作用來鑒別這些蛋白，這種方法是通過檢測殘留在細(xì)胞中的b-catenin 量來達(dá)到的。

 

可以通過高效系統(tǒng)的成像技術(shù)使這種定量技術(shù)變得簡單，從而進一步提高檢測和分析的質(zhì)量。為了有助于這一研究，利用Molecular Devices 公司的高內(nèi)涵成像系統(tǒng)基于細(xì)胞水平的檢測技術(shù)，我們已經(jīng)建立了包含1856 種新蛋白的庫，這使我們能準(zhǔn)確的通過wnt 信號通路的影響程度來檢測細(xì)胞核中b-catenin 的量。

 

U2OS 細(xì)胞可以表達(dá)融合了綠色熒光蛋白（EGFP）的人源.-catenin，我們在384 孔板中每孔加入1500 個細(xì)胞。細(xì)胞37 度培養(yǎng)48 小時后，加入庫中篩選的蛋白。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h然后用含5μg/mL Hoechst 33342 DNA 染料的4%多聚甲醛進行固定染核。在此基礎(chǔ)上，我們對庫中的活性蛋白進行了進一步的篩選，結(jié)果后面會顯示。

 

ImageXpress. Micro Widefield System 可以對目標(biāo)進行高通量成像測定。采用10 倍物鏡雙波長光分別檢測EGFP 熒光和Hoechst 核染料，每孔檢測4 個位點。在每個視野中捕獲到放大10 倍超過1000 個細(xì)胞的數(shù)據(jù)，而且還可以持續(xù)的保持這種高質(zhì)量的分析結(jié)果。

 

由于蛋白酶持續(xù)的降解ß-catenin，在正常表達(dá)ß-catenin-EGFP 的細(xì)胞系的胞質(zhì)和胞核中我們無法觀測到綠色熒光。在這種情況下我們僅能在與殘留的鈣粘素作用的胞膜上觀察到微弱的信號（圖2，左）。如果抑制了Wnt 信號通路（例如用GSK-3ß抑制劑），在核中就會根據(jù)所用抑制劑的劑量積累對應(yīng)的ß-catenin-EGFP（圖2，右）。

 

圖2 所示圖像由10 倍物鏡獲得。正常表達(dá)Wnt 蛋白，EGFP 模糊可見分散在細(xì)胞膜上，并沒有在細(xì)胞核中積累（左）。GSK-3ß處理后，EGFP 熒光轉(zhuǎn)移到核中（右）。

 

MetaXpress® 軟件中的Translocation-Enhanced 應(yīng)用模塊可以被用來鑒定核中以及定量與細(xì)胞核相關(guān)的其余部分中ß-catenin-EGFP 的量（圖3）。對細(xì)胞核區(qū)間的劃分來源于被Hoechst 核染料染色的區(qū)域。然后用第二種波長的光（EGFP）將細(xì)胞劃分出新的區(qū)間，這一區(qū)間的大小和寬度可以滿足特異性的檢測。這保證了每個區(qū)間都有足夠的綠色熒光強度，如細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜都可以進行定量分析。交互式模塊隨著參數(shù)的調(diào)整可以及時的反饋信息，這也使我們能對每個特定的檢測結(jié)果進行準(zhǔn)確分析。

 

圖3 應(yīng)用Translocation-Enhanced 分析模塊，根據(jù)核染色確定核區(qū)域及細(xì)胞質(zhì)區(qū)域（上）。MetaXpress 軟件支持自由調(diào)整設(shè)置參數(shù)，從而精確圈定出各組分的范圍，通過評分得到陽性或陰性結(jié)果（下）。

 

MetaXpress®軟件的Translocation-Enhanced應(yīng)用模塊可以通過一系列的算法將細(xì)胞的計分標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化。除了檢測特定細(xì)胞區(qū)域所有檢測波長下每個細(xì)胞和圖像的平均以及總體的熒光強度，系統(tǒng)還可以從整個細(xì)胞區(qū)域中兩種染料的熒光強度計算出皮爾森相關(guān)系數(shù)。系數(shù)的范圍從-1（負(fù)相關(guān)）到1（完全相關(guān)）。在這個例子中，可以看到核與ß-catenin-EGFP 高度相關(guān)（圖4）。隨后，通過計算核區(qū)域和胞質(zhì)平均熒光強度的比率可以得到劑量效應(yīng)曲線（圖5）。檢測結(jié)果的穩(wěn)定性可以通過計算z 值來評估。

 

圖4 應(yīng)用Translocation-Enhanced 分析模塊，DMSO 處理的陰性對照和MG132 處理的陽性對照依據(jù)轉(zhuǎn)位情況產(chǎn)生蒙板，若計算出的皮爾斯系數(shù)大于0.5 被記為陽性，圖中顯示為綠色，若小于0.5 則為陰性，顯示為紅色。

 

這種通過檢測待測化合物影響相關(guān)信號通路從而干擾.-catenin 運輸?shù)募夹g(shù)僅僅是高效檢測細(xì)胞間運輸情況的一個特例。即使低倍率放大，也可得到高質(zhì)量圖片的技術(shù)，可以從統(tǒng)計意義上對相關(guān)化合物進行準(zhǔn)確的測定。將細(xì)胞水平上的報告基因檢測技術(shù)和Molecular Devices 提供的高通量篩選技術(shù)結(jié)合在一起，實驗者就可以完美解決細(xì)胞不同區(qū)域間的蛋白運輸活動的測定。

 

圖5 濃度相關(guān)曲線如圖所示，左為陽性化合物MG132，右為樣品化合物A。根據(jù)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的平均熒光強度比值得出IC50。陽性化合物的Z 值大于0.7 說明實驗重復(fù)性好。