FLIPR^TETRA系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PH值變化的實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)介

FLIPR^TETRA系統(tǒng)可用于完成多數(shù)細(xì)胞基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)研究。本篇應(yīng)用研究推薦了細(xì)胞內(nèi)pH值檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在FLIPR上運(yùn)行的基礎(chǔ)方案。實(shí)驗(yàn)在貼壁細(xì)胞上完成，同時(shí)還討論了一些重要參數(shù)的優(yōu)化。因?yàn)槊糠N細(xì)胞系都有其獨(dú)有的特性，每個(gè)研究人員在進(jìn)行自己的實(shí)驗(yàn)時(shí)都需要進(jìn)行單獨(dú)的優(yōu)化。

細(xì)胞內(nèi) pH 實(shí)驗(yàn)的原理

Na⁺/H⁺ exchanger（NHE）排出氫離子同時(shí)泵入鈉離子，以維持pH穩(wěn)定性。BCECF是pH敏感的染料，其在堿性條件下吸光度更高，反之酸性條件下變低。從而BCECF可被用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH變化進(jìn)而反應(yīng)NHE活性。加入BCECF孵育細(xì)胞，之后加入NH₄Cl，NH₄Cl有助于促進(jìn)染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且NH₃會(huì)造成堿性環(huán)境（高熒光信號(hào)）。當(dāng)NH₄Cl被FLIPR加入的溶液稀釋后，NH₃擴(kuò)散出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)H⁺濃度升高，進(jìn)而引起熒光信號(hào)的快速下降。這些H⁺將會(huì)被NHE泵出細(xì)胞（熒光信號(hào)的緩慢升高與NHE活性是相對(duì)對(duì)應(yīng)的）。

細(xì)胞準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)前一天細(xì)胞種在多孔板中，之后的所有步驟均在96孔板或384孔板中完成。具體操作步驟如下：

1. 在96或384孔板中種上細(xì)胞

2. 加載BCECF至細(xì)胞中孵育45分鐘

3. 加入20 mM NH₄Cl至細(xì)胞板中以酸化細(xì)胞，孵育15分鐘

4. 用含20 mM NH₄Cl的緩沖液清洗細(xì)胞

5, 用FLIPR進(jìn)行檢測(cè)；NH₄Cl緩沖液用大體積的平衡鹽溶液和各種配體/對(duì)照品進(jìn)行稀釋。

優(yōu)化細(xì)胞種板的密度是很有必要的，保證了過(guò)夜培養(yǎng)后每孔可以形成密度相似的均一單細(xì)胞層。通過(guò)適當(dāng)?shù)恼{(diào)整種板時(shí)的密度，細(xì)胞可以培養(yǎng)超過(guò)一天來(lái)達(dá)到實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的要求。粘附性弱或生長(zhǎng)不規(guī)則的細(xì)胞需要在用多聚賴氨酸、層黏蛋白或膠原蛋白包被過(guò)的多孔板中培養(yǎng)。

染料加載

為了觀察細(xì)胞內(nèi)PH值變化，需要在細(xì)胞中加載pH敏感的熒光染料。不同的細(xì)胞類型其染料加載方案需要進(jìn)行優(yōu)化。

熒光染料

迄今為止，BCECF是最廣泛用于細(xì)胞內(nèi)pH值檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的熒光染料試劑。

陰離子交換蛋白抑制劑

一些類型的細(xì)胞通過(guò)陰離子交換蛋白轉(zhuǎn)移陰離子至細(xì)胞外，這些陰離子包含了熒光染料。這樣不僅僅導(dǎo)致了染料加載效果的減弱，同時(shí)導(dǎo)致了最終數(shù)據(jù)結(jié)果的誤差；當(dāng)待檢測(cè)的化合物被添加后會(huì)由于細(xì)胞外染料被稀釋引起記錄的熒光信號(hào)值急劇地下降。（待檢測(cè)化合物用不含染料的緩沖液稀釋）因而，抑制陰離子交換蛋白活性是FLIPR能否成功檢測(cè)的關(guān)鍵所在。

丙磺舒是一種陰離子交換蛋白抑制劑，被加入到加載培養(yǎng)基中后可以增加染料保留在細(xì)胞內(nèi)的比例。已知的一個(gè)需要丙磺舒的細(xì)胞類型是CHO。盡管丙磺舒可以延緩染料從細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)移至胞外，但其對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)有一定的毒性，因此染料加載后的孵育時(shí)間應(yīng)盡可能控制在最短時(shí)間內(nèi)。 .

苯磺唑酮是另一種陰離子交換蛋白抑制劑。至今，在細(xì)胞內(nèi)pH值檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中很少有使用到苯磺唑酮的信息。

用于染料加載的培養(yǎng)基

測(cè)試了幾種類型的染料加載培養(yǎng)。最佳的培養(yǎng)基應(yīng)能兼顧兩方面——染料加載和良好的細(xì)胞反應(yīng)�？赡艿倪x擇有：

1. 生長(zhǎng)培養(yǎng)基+10% 胎牛血清(FBS) + 20 mM HEPES

2. 生長(zhǎng)培養(yǎng)基+1% FBS + 20 mM HEPES

3.  Hank’s BSS 1X（不含丙磺舒）+ 20 mM HEPES +1% FBS

4.  Hank’s BSS 1X（不含丙磺舒）+ 20 mM HEPES +1% BSA

• 染料加載后的孵育時(shí)間和溫度

最佳的孵育時(shí)間取決于細(xì)胞類型。由于熒光染料對(duì)細(xì)胞是有毒的，所以要嚴(yán)格控制孵育時(shí)間。60分鐘、37°C是通常對(duì)大多數(shù)細(xì)胞都有效的孵育條件，一般也作為方法開(kāi)發(fā)時(shí)的起始推薦條件。

注：如果孵育30分鐘可以得到一個(gè)可接受的熒光信號(hào)，建議采用更短時(shí)間的孵育條件。

細(xì)胞中酸性溶液的加載 細(xì)胞中酸性溶液的加載

這個(gè)步驟不是直接加入酸本身，而是向細(xì)胞中加入NH₄Cl。當(dāng)NH4Cl在細(xì)胞中形成NH₃并使細(xì)胞質(zhì)堿化，隨后當(dāng)NH₄Cl被FLIPR系統(tǒng)添加的溶液稀釋后，NH₃擴(kuò)散至細(xì)胞外使得細(xì)胞內(nèi)殘留高濃度的H⁺。這將激發(fā)NHE的活性并把氫離子排出至細(xì)胞外。

用于此步的溶液是200 mM NH₄Cl。NH₄Cl一直保留在多孔板中，直至FLIPR添加溶液使其被稀釋。

化合物板準(zhǔn)備

在本次實(shí)驗(yàn)中，由于染料加載后孵育的時(shí)間足夠長(zhǎng)，便于準(zhǔn)備所需的化合物板。

準(zhǔn)備化合物稀釋緩沖液

在細(xì)胞內(nèi)pH檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，用于稀釋化合物的緩沖液以及清洗細(xì)胞的緩沖液是不同的（與細(xì)胞內(nèi)鈣流及膜電位實(shí)驗(yàn)相比）。清洗緩沖液含有20 mM NH4Cl，而化合物稀釋緩沖液不含NH4Cl。待檢測(cè)化合物應(yīng)稀釋至實(shí)驗(yàn)時(shí)終濃度的1.25倍。

細(xì)胞清洗

染料加載后并添加了NH₄Cl溶液，需要用清洗緩沖液清洗幾次以去除細(xì)胞外的染料。所有清洗步驟中均需含有20 mM NH₄Cl。建議使用Molecular Devices公司的洗板機(jī)，適用于96孔或384孔板，可調(diào)節(jié)高度和速率。

從FLIPR系統(tǒng)得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)一部分取決于細(xì)胞清洗環(huán)節(jié)的洗板機(jī)性能，是否可以保證最后一次清洗結(jié)束后每個(gè)孔中剩余的體積是一致的。手動(dòng)清洗后得到的結(jié)果差異性更大。另外，如果手動(dòng)清洗切記注意不要在兩次清洗步驟之間吸干孔中溶液使得細(xì)胞直接暴露在空氣中。

注: 清洗緩沖液和稀釋化合物的緩沖液是不一樣的。

運(yùn)行實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前一天將細(xì)胞種在 實(shí)驗(yàn)前一天將細(xì)胞種在 實(shí)驗(yàn)前一天將細(xì)胞種在 實(shí)驗(yàn)前一天將細(xì)胞種在 實(shí)驗(yàn)前一天將細(xì)胞種在 相應(yīng)的黑壁 相應(yīng)的黑壁 相應(yīng)的黑壁 96 或 384孔細(xì)胞板上 ：

1） 加入 BCECF，孵育 45 分鐘

2） 加入 20mM NH ₄Cl ，孵育 ，孵育 15 分鐘

3） 用含 20mM NH₄Cl 的緩沖液清洗細(xì)胞

4） 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)

儀器設(shè)置

下表中FLIPR系統(tǒng)設(shè)置的參數(shù)適用于所有CHO細(xì)胞的BCECF實(shí)驗(yàn)。