[摘要] 目的：研究大鼠長期高脂飲食對其掠食行為的影響及機制。方法：將10只4周齡雌性SD大鼠隨機均分為對照組和高脂組。對照組常規(guī)飼料飼養(yǎng)，高脂組以高脂飼料飼養(yǎng)，15周之后進行曠場實驗、掠食行為觀察，行為學觀察結束后立即處死動物，采用免疫組織化學技術檢測c-Fos蛋白在大鼠前扣帶皮質的表達情況。結果：高脂組大鼠在非競爭性掠食行為與競爭性掠食行為中掠食量均低于對照組(P<0.001)；高脂組前扣帶皮質區(qū)c-Fos蛋白表達低于對照組(P<0.001)。結論：長期高脂飲食可降低大鼠的掠食量，且前扣帶皮質區(qū)c-Fos蛋白表達減少、神經元功能下降。

[關鍵詞] 高脂飲食；掠食行為；礦場實驗；前扣帶皮質；c-Fos；大鼠隨著生活節(jié)奏的加快，人們的飲食結構發(fā)生改變，大量的高脂食物的攝入，既可帶來一系列健康問題，比如肥胖癥、心血管疾病、代謝綜合征、糖尿病等；又可導致人們神經精神方面的異常，如可損傷小鼠的記憶功能，引起小鼠活動性增加和焦慮抑郁行為；還可引起小鼠認知障礙。而關于高脂飲食對掠食行為的研究較少，大鼠的掠食行為涉及其對食物的搬運、囤積以及同其他大鼠的爭搶，是在滿足當下需求的同時，搜尋更多的食物滿足將來的使用，是一種適應與生存的戰(zhàn)略。因此本實驗將觀察長期高脂飲食對大鼠掠食行為的影響，同時觀察大鼠大腦前扣帶皮質c-Fos蛋白表達變化，探究高脂飲食對大鼠掠食行為的影響與機制。

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康清潔級雌Sprague-Dawley (SD)大鼠10只，4 周齡，由中南大學實驗動物中心提供，進入實驗室的體質量為70~90 g。全身健康要求：毛發(fā)色澤光亮，無脫毛，四肢和尾部無疾病，頸部無歪斜。所有大鼠于實驗開始前1周飼養(yǎng)于同一動物房以適應環(huán)境，均能自由飲水和進食，食物為標準顆粒狀飼料。動物房溫度控制于20~22 ℃，通風良

好，保持自然明-暗生物節(jié)律。

1.1.2 飼料和主要設備與化學試劑

大鼠標準的顆粒狀飼料由中南大學實驗動物學部提供；高脂飼料為自制(配方取自章濤等：普通飼料50%，豬油12%，奶粉10%，豆粉5%，花生2.5%，蔗糖5%，菜油1%，食鹽1%)；曠場實驗箱和配套Supermaze軟件為上海欣軟信息科技有限公司產品；Leica冰凍切片機為武漢中紀科學儀器有限公司產品；尼康顯微鏡為尼康儀器有限公司產品；多聚甲醛為天津市科密歐化學試劑有限公司產品；磷酸二氧鈉為國際集團化學試劑有限公司產品；磷酸氫二鈉為長沙安泰精細化工實業(yè)有限公司產品；蔗糖為廣東光華科技股份有限公司產品；0.01 mol/L磷酸能緩沖溶液和DAB顯色劑為北京中山金橋生物技術有限公司產品；c-Fos一抗為美國Santa Cruz公司產品，山羊血清、二抗以及三抗為美國Vector Labs產品；無水乙醇和二甲苯為國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 高脂飲食模型建立

將10只雌性大鼠隨機分成兩組，每組5只。對照組用普通飼料喂養(yǎng)15周，高脂組用自制高脂飼料喂養(yǎng)15周。所有大鼠在造模期間自由攝食和飲水，飼料和水每2日更換1次。

1.2.2 行為學檢測
1.2.2.1 曠場實驗

曠場實驗箱(長×寬×高：100 cm×100 cm×50 cm)，箱底標記成25個相等方格(20 cm×20 cm)，沿四壁的16個方格稱為外圍格，其余9個方格為中央格。進行實驗時將大鼠放于正中央格，攝像并記錄5 min大鼠穿行中央格格數(shù)、穿行的總格數(shù)以及中央格停留時間。在中央格停留時間占總時間(5 min)百分比與大鼠的焦慮樣情緒呈負相關。穿越總格數(shù)反映動物的運動功能。

1.2.2.2 非競爭性掠食行為觀察

掠食模型參照Li等的方法：動物掠食行為的觀察在一單獨、安靜、隔音的房間內進行，房間內放有曠場(長×寬×高：150 cm×150 cm×50 cm)，曠場底及四壁為黑色，待測大鼠進行掠食行為觀察前，需節(jié)食1周，每天給予少量食物，足量飲水，使體質量降到之前的80%左右；然后在觀察前1 d禁食(不禁水)12 h，觀察當日下午4:00將大鼠放入曠場中，適應2 h后，于曠場一側放入一塑料制鼠籠(長×寬×高：30 cm×18 cm×16 cm)，將250 g標準的大鼠顆粒狀飼料放于鼠籠的鐵絲網頂蓋上，2 h后，分別收集鼠籠頂蓋上剩余飼料以及散落在曠場中的飼料，并分別稱重。散落在曠場中的飼料量即為大鼠掠食量。

1.2.2.3 競爭性掠食行為觀察

觀察設備同非競爭掠食行為觀察，觀察前禁食(不禁水)12 h，觀察當日下午4:00將大鼠放入曠場中，適應2 h后，于曠場一側放入一塑料制鼠籠(長×寬×高：30 cm×18 cm × 16 cm)，鼠籠中放置一只同待測大鼠性別相同，來源于不同窩，之前從未接觸的大鼠。將250 g標準的大鼠顆粒狀飼料放于鼠籠的鐵絲網頂蓋上，2 h后，分別收集

散落在曠場中的飼料以及鼠籠頂蓋上剩余飼料，并分別稱重。散落在曠場中的飼料量即為大鼠掠食量。

1.2.3 大鼠前扣帶皮質 c-Fos 蛋白免疫組織化學檢測在大鼠非競爭性掠食進行1 h 45 min時，迅速取出大鼠，用10%水合氧醛(40 mg/kg)于大鼠腹腔注射麻醉后迅速取腦，將腦組織置入固定液中后固定過夜，再分別置于15%，30%蔗糖PBS液中浸糖至沉底，用最佳切割溫度(optimal cuttingtemperature，OCT)復合物包埋，置于恒溫冰凍切片機連續(xù)切片，片厚30 m，取含前扣帶皮質的切片。采用免疫組織化學ABC法對切片行c-Fos免疫組織化學染色、Olympus顯微鏡觀察。對照組與高脂組各選取3張切片，拍照并計數(shù)10×10倍鏡視野下陽性細胞。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用GraphPadPrism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用成組t檢驗，以P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.1 行為學檢測

2.1.1 曠場實驗

曠 場 實 驗 結 果 如 圖 1 所 示 ： 中 央 格 停 留時間百分比，高脂組(10.43%±2.87%)與對照組(12.23%±2.79%)相比，差異無統(tǒng)計學意義( t = 0 . 4 5 0 ， P = 0 . 6 6 4 7 ) ；穿行總格數(shù)，高脂組( 1 2 7 . 1 0 % ± 3 7 . 8 9 % ) 與對照組 ( 9 8 . 9 0 % ± 1 7 . 1 5 % ) 相比，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.676，P=0.5172)。

2.1.2 掠食行為

掠食行為結果如圖2所示：對照組大鼠在非競爭性掠食行為、競爭性掠食行為觀察中，每2 h掠食量分別為(84.80±2.77) g，(89.94±1.96) g。高脂組在非競爭性掠食行為、競爭性掠食行為觀察中，每2 h掠食量分別為(13.85±1.08) g，(12.25±1.07) g；與相應對照組相比掠食量減少(非競爭性掠食行為t=21.65，P<0.001；競爭性掠食行為t=32.17，P<0.001)。

2.2 大鼠前扣帶皮質 c-Fos 蛋白免疫組織化學檢測如 圖 3 所 示 ： 對 照 組 陽 性 細 胞 數(shù) 為( 8 8 . 1 7 ± 4 . 1 4 ) 個 / 視野，高脂組陽性細胞數(shù)為(45.00±2.56)個/視野，對照組陽性細胞數(shù)目高于高脂組(t=8.868，P<0.001)。

掠食行為是一種高度綜合的模型，可用于探討心理學、生理學、神經生物學等多學科的不同問題；同時，掠食行為也是行為科學理論研究的重要模型，掠食行為與決策、努力付出、成本/效益估計等認知功能密切相關。利用掠食行為闡明長期高脂飲食對認知功能的影響，探究長期高脂飲食對大鼠掠食行為的影響及機制，對人們的健康具有指導意義。

許多研究者利用嚙齒類動物掠食行為探討認知功能的神經生物學機制之前，往往要對動物進行人為訓練，過多的訓練影響大鼠的行為自主性，從而影響到掠食行為結果，不能反映其真實的神經生物學本質。因此，筆者采用了Li等的實驗室大鼠掠食行為觀察模型排除了人為因素對大鼠掠食行為的影響，并且定量測定大鼠的掠食行為，探討其神經生物學機制。

曠場實驗是評價嚙齒類實驗動物運動功能和狀態(tài)焦慮的經典方法。我們以此來判定不是由運動能力、探究行為、動物情緒等改變造成動物掠食行為障礙。對照組與高脂組礦場實驗結果表明，兩組差異無統(tǒng)計學意義，提示高脂飲食對大鼠運動功能無影響。

本研究發(fā)現(xiàn)高脂組大鼠在非競爭性掠食行為、競爭性掠食行為中掠食量較對照組明顯減少，這提示高脂組大鼠不愿付出努力去獲取更多的食物，表明高脂飲食確實會影響大鼠掠食行為。

中樞神經系統(tǒng)多個腦區(qū)以及多種化學物質參與調控嚙齒類動物的掠食行為。前扣帶皮質位于前額葉的內側部分，參與調控認知、學習、社會評估等復雜行為。前扣帶皮質受到毀損的靈長類個體在強化介導的選擇任務中不能正確地整合風險和回報。嚙齒類動物前扣帶皮質受損研究表明：前扣帶皮質受損的大鼠放棄“付出越多得到越多”的行為，更愿意少花力氣獲得少的收入。李明波等研究表明：雙側前扣帶皮質損毀后的大鼠掠食行為明顯受損，其中競爭性掠食量下降最為明顯。本研究結果顯示高脂組大鼠的掠食量明顯減少，推測高脂飲食大鼠掠食行為障礙可能與前扣帶皮質功能改變有關。c-Fos蛋白作為參與細胞內信號轉導功能的第三信使，其表達可反映神經元對某種刺激的活動情況，常被作為神經元激活的標志。本研究中高飲食大鼠在掠食過程中前扣帶皮質內c-Fos表達明顯減少，提示長期高脂飲食影響大鼠掠食行為的機制可能與前扣帶皮質區(qū)神經元功能下降有關；具體的機制仍需進一步的探討。