作者：張坤博士 徠卡顯微系統(tǒng) 生命科學(xué)部 應(yīng)用專員

熒光顯微鏡在研究活細(xì)胞中蛋白質(zhì)分子的定位、相互作用及動(dòng)力學(xué)等生命活動(dòng)中起著不可或缺的作用。將熒光蛋白如綠色熒光蛋白和目的蛋白融合表達(dá)，然后利用熒光蛋白發(fā)出的特異性熒光來觀察和追蹤目的蛋白分子在科學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。但是熒光蛋白具有量子產(chǎn)量低、成熟速度受限、光譜容易受到環(huán)境因素影響及容易形成聚集體等缺點(diǎn)，這些在一些特殊的顯微熒光成像中會(huì)造成假象而影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，科學(xué)家們也開始尋找、發(fā)明越來越合適的活細(xì)胞標(biāo)記方法，以配合越來越精準(zhǔn)的顯微成像（如超高分辨率等）技術(shù)來更加真實(shí)的觀察、記錄各種微觀生命活動(dòng)。本文中重點(diǎn)介紹了SNAP-tag和SiR等新型標(biāo)記方法和染料的特征及應(yīng)用。

SNAP-tag技術(shù)簡介

圖1. SNAP-tag標(biāo)記示意圖。該標(biāo)記方法具有特異性高、速度快、穩(wěn)定性高及熒光探針選擇靈活多樣等優(yōu)點(diǎn)

如何才能將活細(xì)胞中的目的蛋白標(biāo)記上特異的熒光信號(hào)呢？談到特異性，科學(xué)家們首先考慮到的是酶和底物的相互作用。因此，從酶促反應(yīng)出發(fā)，瑞士洛桑理工學(xué)院的Kai Johnsson科研小組發(fā)現(xiàn)人類DNA修復(fù)酶（alkylguanine-DNAalkyltransferase，AGT）可以特異性并快速地與苯甲基鳥嘌呤（benzylguanine, BG）衍生物發(fā)生反應(yīng)，以共價(jià)鍵結(jié)合。隨后，對(duì)AGT進(jìn)行了突變改造，獲得了一種不與DNA鏈上的鳥嘌呤進(jìn)行反應(yīng)的蛋白Snap-tag，該蛋白不再定位于細(xì)胞核中，但與小分子BG衍生物的親和力卻大大地提高現(xiàn)在[1-2]。SNAP-tag只有20KDa大小，因此可以將目的蛋白與SNAP-tag融合表達(dá)。將帶有熒光探針標(biāo)記的BG導(dǎo)入細(xì)胞后，BG與SNAP-tag會(huì)快速的發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中特異性目的蛋白的熒光標(biāo)記（圖1）�？茖W(xué)家可以特異性的選擇細(xì)胞膜通透性的或非通透性的BG底物，分別用于研究膜表面分子和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的分子[3]。相對(duì)于熒光蛋白表達(dá)，SNAP-tag標(biāo)記的最大的優(yōu)點(diǎn)是熒光探針的靈活選擇性，如熒光染料、量子點(diǎn)、金顆粒及光激活、光轉(zhuǎn)換的染料等，目前NEB等公司已經(jīng)將SNAP-tag的表達(dá)載體和這些底物廣泛商品化，熒光探針的光譜選擇也非常靈活（表1）。鑒于其使用的便捷性，SNAP-tag已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，如用于研究蛋白的半衰期、運(yùn)輸及相互作用等[4-6]。Johnsson研究小組通過對(duì)SNAP-tag進(jìn)行改造，獲得了一種新的CLIP-tag，經(jīng)過基因改造，使其不與芐基鳥嘌呤衍生物結(jié)合，而與芐基胞嘧啶衍生物（Benzylcytosine, BC）結(jié)合[7]。CLIP-tag與SNAP-tag聯(lián)合使用，能夠同時(shí)標(biāo)記同一個(gè)細(xì)胞中兩個(gè)不同的蛋白，使這種tag自我標(biāo)記型的標(biāo)記方法的應(yīng)用得到了進(jìn)一步的拓展[8-11]（表1）。在實(shí)際操作中，研究者將熒光標(biāo)記的底物加入表達(dá)SNAP-tag或CLIP-tag的細(xì)胞中，待結(jié)合完成后清洗幾次以去除未結(jié)合的熒光底物即可進(jìn)行成像，非常簡單便捷。

表1.目前NEB公司提供的多種多樣的SNAP-tag和CLIP-tag底物

SNAP-tag技術(shù)在STED超高分辨率顯微成像中的應(yīng)用

近十年中，顯微成像技術(shù)得到了飛躍的發(fā)展，填補(bǔ)光學(xué)顯微鏡（~200 nm）到電子顯微鏡（~0.1 nm）分辨率缺口，打破光學(xué)衍射極限的超高分辨率顯微鏡也越來越趨于成熟化。其中，德國馬普研究所的Stefan Hell教授憑借其研發(fā)的受激發(fā)射損耗（Stimulatedemission depletion，STED）技術(shù)榮獲2014年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。STED超高分辨率顯微鏡是架構(gòu)在共聚焦顯微鏡上，因此其成像速度非�？欤�可以廣泛的應(yīng)用于活細(xì)胞的超高分辨率成像。除了傳統(tǒng)的YFP等熒光蛋白可以用于STED活細(xì)胞超高分辨率成像，SNAP-tag和CLIP-tag可以非常簡便的的將AlexaFluo等有機(jī)染料引入活細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中多色超高分辨率成像。有機(jī)染料具有更好的光穩(wěn)定性，光譜的選擇也更加靈活，配合SNAP-tag和CLIP-tag標(biāo)記的特異性和穩(wěn)定性，可以更優(yōu)秀的服務(wù)于長時(shí)間的活細(xì)胞超高分辨率顯微成像。Joerg B等科學(xué)家用SNAP-tag/BG-94和CLIP-tag/BC-647分別標(biāo)記了表皮生長因子受體（EGFR）和表皮生長因子（EGF）（圖2），利用STED超高分辨率顯微鏡解析了兩者在活細(xì)胞中的相互作用（圖3）[12]。

圖2.SNAP-tag/BG-494和CLIP-tag/BC-647N分別標(biāo)記EGFR和EGF的示意圖。原則上EGFR和EGF結(jié)合后會(huì)形成同源二聚體，在這里考慮到示意圖的簡潔清晰性，EGFR仍然以單體的形式表示。

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