實驗方案及色譜條件

點擊下載全部方案： 利用沃特世Prep 150 LC系統(tǒng)分離銀杏葉中的黃酮類化合物 

提取

將銀杏葉粉末(20 g)加入100 mL甲醇中，超聲60 min。加入40 mL 3N的鹽酸后，將此混合物加熱至沸騰并回流90 min。此回流操作可將黃酮苷水解成單個的黃酮化合物。冷卻至室溫后，使用Whatman #1濾紙對提取物進行過濾即可，無需進一步處理。

結果與討論

對制備所得的提取物進行梯度UPLC^®分析，結果顯示其中槲皮素和山柰酚的濃度分別為0.088和0.104 mg/mL(未獲得異鼠李素的定量標準品)，根據(jù)UV (371 nm)條件下測得的峰面積百分比計算所得三種化合物的總體純度約為11%，14%和5%(圖3)。借助于先前開發(fā)出的分析級等度HPLC方法(圖4)，使用內置于ChromScope軟件中的Analytical to Prep Gradient Calculator(分析級至制備級梯度計算器，圖5)可計算出幾何放大至內徑為19 mm的色譜柱時所需的制備級分離流速。分析級至制備級梯度計算器是一款簡便且易用的工具，可進行分析級至制備級操作的幾何縮放計算，提供流速與梯度時間計算信息。分析級方法到制備級方法的準確放大可實現(xiàn)在分析級規(guī)模下進行方法開發(fā)，從而能夠節(jié)省樣品并減少方法開發(fā)所需的溶劑使用量。放大的制備級色譜會與分析級色譜十分相似，使用戶能夠準確地通過放大的制備級方法收集目標峰。之前發(fā)布的應用紀要3中對此類放大計算提供有更詳細的描述。

實驗通過等度純化分離方法和基于閾值的餾分收集方法，使用0.25 mL的進樣量實現(xiàn)了結果可接受的制備級分離(圖6)。通過ChromScope軟件可設置在收集時間段中通過閾值收集輕松實現(xiàn)各餾分的收集(圖7)。本示例中定義了一對收集時間段(3.0至4.0 min和6.0至7.5 min)，定義時間段以外洗脫出的所有峰都不會收集到最終的組分中。每個定義時間段中的洗脫峰必須滿足峰閾值條件(本示例中第一個時間段的閾值為25 mAU，第二個時間段閾值為15 mAU)
才能實現(xiàn)正確的收集操作。根據(jù)UPLC分析(數(shù)據(jù)未示出)，所收集餾分的純度分析顯示三種化合物的紫外吸收峰面積%純度分別為87%、96%和85%。

結論

■ 本實驗采用沃特世Prep 150 LC制備級HPLC系統(tǒng)對銀杏葉粉末提取物中的物質進行了分離與純化。
■ 沃特世ChromScope軟件(1.4版)的全面化系統(tǒng)控制提供了出色的系統(tǒng)靈活性，用戶可對所有的方法參數(shù)進行輕輕修改。
■ 實驗先開發(fā)出了分析級分離方法，然后利用分析級至制備級梯度計算器將此方法幾何放大至Prep 150 LC系統(tǒng)上的19×100 mm制備級色譜柱。
■ 簡單易設置的餾分收集實現(xiàn)了目標化合物的精確收集。
■ 初始提取物中包含15%的槲皮素和18%的山柰酚，通過這套易于使用的Prep 150 LC系統(tǒng)可將每種組分的純度提高到87%以上。

參考文獻

1. PDR for Herbal Medicines, 4th Ed., 2007, Thompson Healthcare Inc,Montvale NJ, U.S.A.
2. Natural Products Isolation 2nd edition, edited by S.D. Sarker, Z. Latif, A.I.,2006 Humana Press Inc, Totowa, NJ, U.S.A.
3. “Analytical HPLC to Preparative HPLC: Scale Up Techniques usinga Natural Product Extract.” Andrew Aubin and Ronan Cleary.Waters Application Note 720003120en, 2009