立體顯微鏡通常被稱為實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)部門的主力。選擇立體顯微鏡時(shí)，需要考慮哪些因素呢？ 答案是：“看情況”。這是為什么呢? 因?yàn)樗�取決于用途，取決于用戶想要完成的任務(wù)。立體顯微鏡基本上是一種工具，用于將三維目標(biāo)在三個(gè)維度中放大。 不同于復(fù)式顯微鏡，立體顯微鏡能夠應(yīng)付這個(gè)任務(wù)。

背景知識(shí)

格里諾和 Cycloptic®原理

過(guò)去的雙目顯微鏡，其特點(diǎn)是透鏡系統(tǒng)簡(jiǎn)單，而且設(shè)計(jì)和傳統(tǒng)的復(fù)式顯微鏡相同。 此類解剖顯微鏡，正如當(dāng)時(shí)所熟知的那樣，主要用于生物學(xué)中的解剖用途；當(dāng)時(shí)沒(méi)有技術(shù)上的應(yīng)用。大約在 1890 年，美國(guó)生物學(xué)家和動(dòng)物學(xué)家霍雷肖•S•格里諾（Horatio S. Greenough）采用了一項(xiàng)設(shè)計(jì)原理，今天仍為光學(xué)儀器的所有主要制造商所使用。“格里諾原理”基礎(chǔ)上的立體顯微鏡，實(shí)現(xiàn)了真正的高質(zhì)量立體圖像。

1957 年，美國(guó)光學(xué)公司采用了帶有共用主物鏡的現(xiàn)代立體顯微鏡設(shè)計(jì)，并命名為Cycloptic®。它的現(xiàn)代鋁外殼下，是兩道平行的光束的路徑和主物鏡，以及一個(gè)五步變倍器。此種立體顯微鏡，制造商除采用格里諾原理外，還采用望遠(yuǎn)鏡或 CMO（普通主物鏡）原理，并用于模塊化的、高性能的儀器。兩年后，另一家美國(guó)公司博士倫提出了 StereoZoom® 格里諾設(shè)計(jì)，作出了開(kāi)創(chuàng)性的創(chuàng)新： 一步到位的變倍器（變焦）。 今天幾乎所有的設(shè)計(jì)都是基于一個(gè)變焦系統(tǒng)。

（左）：Cycloptic®，基于望遠(yuǎn)鏡原理的第一臺(tái)立體顯微鏡圖 2a、b （右）：立體顯微鏡的兩種基本原理。a：望遠(yuǎn)鏡或 CMO 原理 b：格里諾原理。

立體顯微鏡的選擇標(biāo)準(zhǔn)

時(shí)至今日，立體顯微鏡仍基于提到的技術(shù)方法——格里諾或 CMO 原理。

四個(gè)事項(xiàng)需要仔細(xì)評(píng)估：

a）用途是什么？
b）哪種結(jié)構(gòu)需要觀察、記錄或可視化？
c）有多少人在使用顯微鏡？
d）解決方案的可用預(yù)算是多少？

一旦上述因素已知，則可以歸結(jié)為以下標(biāo)準(zhǔn)。

放大倍數(shù)、變焦范圍和物場(chǎng)

景深和數(shù)值孔徑

光學(xué)質(zhì)量和工作距離

人體工學(xué)

照明

放大倍數(shù)、變焦范圍和物場(chǎng)

立體顯微鏡的總放大倍數(shù)，是變倍器、物鏡和目鏡的放大倍數(shù)的組合。

變倍器或變焦體

像放大鏡一樣，變倍器由光學(xué)透鏡構(gòu)成，可以用來(lái)改變儀器的放大倍數(shù)。改變變倍器的位置，會(huì)改變圖像放大的程度。圖像放大的程度稱為放大倍數(shù)。現(xiàn)代立體顯微鏡能夠提供 16 倍放大（只有變焦體），20.5:1 的變焦范圍，其特點(diǎn)是能夠進(jìn)行可靠測(cè)量的機(jī)動(dòng)化或編碼。

接下來(lái)，圖像通過(guò)目鏡得到進(jìn)一步放大。為找出目鏡中觀察到的目標(biāo)的放大程度，用戶必須將變倍器和目鏡的放大倍數(shù)相乘。

然而為了保證完整性，提供公式如下：

MTOT VIS 為我們要計(jì)算的放大倍數(shù)。 VIS 代表“視覺(jué)”。

z 是變倍器的等級(jí)。

ME 為目鏡的放大倍數(shù)。
MO 為主物鏡的放大倍數(shù)（當(dāng)格里諾系統(tǒng)中未使用輔助透鏡時(shí)為 1 倍）

物場(chǎng)

當(dāng)從適當(dāng)?shù)木嚯x向目鏡中觀察、而且瞳孔間距設(shè)置正確時(shí)，可以看到稱為物場(chǎng)的一個(gè)圓形區(qū)域。 物場(chǎng)的直徑根據(jù)放大倍數(shù)而變化。換言之，放大倍數(shù)和物場(chǎng)直徑之間存在著數(shù)學(xué)關(guān)系。 10 倍目鏡提供的物場(chǎng)數(shù)是23。這意味著變焦體和主物鏡放大 1 倍時(shí)，物場(chǎng)大小為23mm。 3 倍放大時(shí)物場(chǎng)減少到三分之一，即物場(chǎng)的直徑僅有7.66mm。

景深和數(shù)值孔徑

在顯微鏡中，景深往往被視為一種經(jīng)驗(yàn)參數(shù)。 實(shí)際上它是由數(shù)值孔徑、分辨率和放大倍數(shù)之間的相關(guān)性確定的。為了得到最佳視覺(jué)印象，現(xiàn)代顯微鏡的調(diào)整設(shè)施會(huì)在景深和分辨率——在理論上具有負(fù)相關(guān)性的兩個(gè)參數(shù)——之間產(chǎn)生一種最佳平衡。

視覺(jué)景深的實(shí)際價(jià)值

在視感景深這個(gè)問(wèn)題上，Max Berek 是第一位發(fā)表觀點(diǎn)的作者，早在 1927 年他就發(fā)表了經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)得來(lái)的結(jié)果。Berek 公式給出了視覺(jué)景深的實(shí)際值，因此今天仍然使用。

其簡(jiǎn)化形式如下：

TVIS：視感景深

n：目標(biāo)位于其上的介質(zhì)的折射率。 如果目標(biāo)被移開(kāi)，則在公式中輸入介質(zhì)的折射率，該介質(zhì)形成變化的工作距離。

λ：使用的光的波長(zhǎng)，對(duì)白光來(lái)說(shuō)，λ = 0.55μm

NA：目標(biāo)一側(cè)的數(shù)值孔徑

MTOT VIS：顯微鏡的視覺(jué)總放大倍數(shù)

如果以上方程中，視覺(jué)總放大倍數(shù)為有效放大倍數(shù)所取代（MTOTVIS = 500 - 1000 x NA），則可以看出，景深的第一個(gè)近似值與數(shù)值孔徑的平方成反比。

特別是放大倍數(shù)較低時(shí)，景深可以通過(guò)縮小鏡頭光圈（即減少數(shù)值孔徑）顯著增加。 這通常是通過(guò)光圈或一共軛平面上的光圈完成的。然而，數(shù)值孔徑越小時(shí)，橫向分辨率就越低。

因此問(wèn)題是找到分辨率與景深（取決于目標(biāo)結(jié)構(gòu)）之間的最佳平衡。在立體顯微鏡中，為了更高的景深，常常需要做出一定的妥協(xié)，因?yàn)槿�維結(jié)構(gòu)的 z 值經(jīng)常有此要求。

帶景深的格里諾立體顯微鏡的目標(biāo)平面

更多景深——FusionOpticsTM

FusionOptics™是一種復(fù)雜的光學(xué)方法，能夠消除立體顯微鏡中分辨率和景深之間的關(guān)系。在這里，光路之一為觀察者的一只眼睛提供了高分辨率和低景深的一副圖像。通過(guò)第二光路，另一只眼睛看到相同目標(biāo)的低分辨率和高景深的圖像。人類大腦會(huì)將兩個(gè)獨(dú)立的圖像組合成一個(gè)最佳整體圖像，其特點(diǎn)是分辨率高和景深高。

另一個(gè)說(shuō)明人類大腦非凡能力的例子是格里諾立體顯微鏡。在這里，左右光路的目標(biāo)平面彼此形成一個(gè)微小的角度。在整體圖像中，產(chǎn)生的整個(gè)區(qū)域似乎顯得清晰,盡管左邊或右邊的圖像并非如此。

現(xiàn)代立體顯微鏡，其特點(diǎn)是 20.5:1 變焦范圍、APO 校正光學(xué)系統(tǒng)和 FusionOptics™。

光學(xué)質(zhì)量

立體顯微鏡的光學(xué)質(zhì)量通常列為 Achro 或 Achromat（消色差），以及 Apo（復(fù)消色差），代表球形和色差的最高程度的校正。場(chǎng)曲率校正縮寫為 Plan，而 PlanApo 是色差和場(chǎng)曲率校正的組合。

Achro, Achromat：消色差校正

Plan：平場(chǎng)光學(xué)校正

PlanApo：復(fù)消色差和平場(chǎng)校正

色差是什么?

在立體顯微鏡等光學(xué)儀器中，色差是一種失真，鏡頭無(wú)法將所有顏色集中到同一個(gè)會(huì)聚點(diǎn)。這是因?yàn)殓R頭對(duì)不同波長(zhǎng)的光有不同的折射率(透鏡的色散)。折射率隨著波長(zhǎng)的增加而減少。良好的光學(xué)設(shè)計(jì)的目的，是減少或完全消除此種影響。

消色差透鏡是一種旨在限制色差和球面像差的影響的透鏡。消色差透鏡經(jīng)過(guò)校正后，將兩種波長(zhǎng)（通常為紅色和藍(lán)色）聚焦到同一個(gè)平面上。此類透鏡或顯微鏡用于以下任務(wù)，即無(wú)需顏色復(fù)現(xiàn)和主要是評(píng)估幾何特性。另一方面，復(fù)消色差透鏡旨在較正三種波長(zhǎng)（紅、綠和藍(lán)色），將它們聚焦到同一個(gè)平面上。工作距離

這是標(biāo)本聚焦時(shí)，物鏡前鏡頭和和標(biāo)本頂部之間的距離。在大多數(shù)情況下，物鏡的工作距離隨著放大倍數(shù)增加而減少。在立體顯微鏡中，工作距離是最重要的標(biāo)準(zhǔn)之一，因?yàn)樗�直接影響著顯微鏡作為工具的可用性。

人體工學(xué)鏡筒——身體和頭部放松，手臂有舒適支撐，腿部有足夠空間，并充分利用椅子。

人體工學(xué)——千人千樣

人有高有矮，這使得儀器需求成為個(gè)人問(wèn)題。例如，為一定的任務(wù)配備的顯微鏡，有配件和特定的工作距離，其現(xiàn)有高度可能相當(dāng)不適合特定的用戶。如果觀察高度過(guò)低，觀察者在工作時(shí)將被迫向前彎曲，導(dǎo)致頸部肌肉緊張。因此在理想狀態(tài)下，顯微鏡的觀察高度和視角，應(yīng)根據(jù)用戶的體形調(diào)整。此外，可變的觀察高度，是用來(lái)防止完全久坐不動(dòng)的姿勢(shì)的最佳方法。它允許觀察者采用個(gè)人坐姿，并按照自然的沖動(dòng)周期性地改變，以便不時(shí)左右移位。的確，椅子的高度可以改變，這樣一種放松、微微彎曲的姿勢(shì)代替了之前的正襟危坐，但這不是最佳方法。更簡(jiǎn)單、更舒適的方法是使用一種可變的雙目鏡筒，以彌補(bǔ)身高的差異。

由于采用了模塊化產(chǎn)品的方法，帶有 CMO 設(shè)計(jì)的立體顯微鏡可以根據(jù)用戶的尺碼或工作習(xí)慣提供的多種方式定制儀器，因而是首選方案。

照 明

在立體顯微鏡中，照明是將所有的工作暴露在光線下的關(guān)鍵。正確的照明將僅僅通過(guò)改變光的類型，便使所需的結(jié)構(gòu)可視化，或有關(guān)樣品的新信息被發(fā)現(xiàn)。重要的是，將照明正確地匹配到正確的顯微鏡和正確的用途上。

現(xiàn)代立體顯微鏡照明系統(tǒng)基于持久的發(fā)光二極管，并提供獨(dú)特的方式，將解決方案整合到整個(gè)顯微鏡系統(tǒng)。高度整合的環(huán)形光源和使用中的偏振器，是為了減少標(biāo)本上的眩光。

照明類型

入射

入射光主要用于不透明的標(biāo)本。此種光（環(huán)形光、射燈等）的實(shí)現(xiàn)方法將取決于標(biāo)本紋理和使用需求。入射光為各種各樣不透明的標(biāo)本所需要。根據(jù)標(biāo)本紋理和結(jié)果目標(biāo)，入射照明方案的一種折衷選擇是可用的。

透射光

透射光對(duì)于各種透明標(biāo)本很理想，范圍從生物樣品（如生物模型）到聚合物。

標(biāo)準(zhǔn)透射明視野照明

標(biāo)準(zhǔn)透射明視野照明用于所有類型的透明標(biāo)本，其具有高對(duì)比度和足夠的顏色信

斜透射照明

此種照明技術(shù)用于幾乎透明、無(wú)色的標(biāo)本。由于照明的斜位置，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)本更大的對(duì)比度和視覺(jué)清晰度。

暗視場(chǎng)照明

立體顯微鏡中的暗視場(chǎng)觀察，需要一個(gè)包括反射鏡和遮光板的特制的臺(tái)子，以便將一個(gè)倒置的照明空心錐體以傾斜角度向標(biāo)本方向移動(dòng)。暗視場(chǎng)照明的原理要素，對(duì)于立體顯微鏡和更傳統(tǒng)的復(fù)式顯微鏡是相同的，通常配有復(fù)雜的多鏡頭聚光鏡系統(tǒng)、或帶有特制內(nèi)鏡的聚光鏡，該內(nèi)鏡包含調(diào)整為特定幾何形狀的反射面。

清晰、透明標(biāo)本的對(duì)比方法

Rottermann Contrast™ 是一種局部照明技術(shù),其顯示亮度不同時(shí)折射率的改變。相位結(jié)構(gòu)通常在正地形對(duì)比中表現(xiàn)為立體的、浮雕式的圖像（如山丘），而在倒轉(zhuǎn)地形對(duì)比中表現(xiàn)為凹進(jìn)。此種技術(shù)提供了許多變量視圖，以此提取最大可能的信息量。

結(jié) 論