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                                當前位置 > 首頁 > 技術(shù)文章 > 常規(guī)PCR反應(yīng)的優(yōu)化

                                常規(guī)PCR反應(yīng)的優(yōu)化

                                瀏覽次數(shù):2780 發(fā)布日期:2014-9-8  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負
                                A. DNA模板:
                                ·   盡量使用高質(zhì)量、純化后的DNA作為模板
                                ·   需要提高保真度時,可使用較高的DNA模板濃度并減少循環(huán)數(shù)
                                ·   模板用量:以50 μl反應(yīng)體系為例——
                                        人基因組DNA:0.1~1.0 μg
                                        大腸桿菌基因組DNA:10~100 ng
                                        Lambda DNA:0.5~5 ng
                                        質(zhì);虿《綝NA:0.1~10 ng
                                B. 引物設(shè)計原則:
                                ·  引物長度要滿足特異性需要,一般可在18~25個堿基之間;擴增長片段時最好在24~30個堿基之間;
                                ·  當引入克隆位點時,引物末端應(yīng)額外增加3個以上堿基;
                                ·  (G+C)%含量應(yīng)盡量控制在40~60%,兩條引物的(G+C)%含量應(yīng)盡量接近;
                                ·  引物中GC堿基分布均勻;
                                ·  盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上,3’端應(yīng)避免使用A或T;
                                ·  避免引物內(nèi)部自身配對形成二級結(jié)構(gòu);
                                ·  正反向引物之間應(yīng)避免配對堿基,尤其是3’端的三個堿基,否則易生成引物二聚體(Primer dimer);
                                ·  兩條引物的解鏈溫度(Tm)值應(yīng)在42~65℃之間,而且兩條引物間最好相差不超過5℃;
                                ·  引物Tm值的計算方法:
                                       20 nt以下:Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)
                                       20 nt以上:Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt:引物的堿基數(shù))
                                ·  引物用量:
                                ·  0.1~1.0 μM,通?梢0.2 μM起始,根據(jù)體系不同調(diào)整用量;
                                ·  使用簡并引物、隨機引物時,需增加引物總量以彌補產(chǎn)量損失;但隨著引物量加大,特異性將降低;
                                ·  模板較大較多,或結(jié)構(gòu)較復雜(如人基因組DNA)時,需減少引物用量以提高特異性;
                                ·  模板較小較少(如質(zhì)粒模板)時,增加引物用量可提高產(chǎn)量。
                                C. 核苷酸(dNTPs):
                                ·  常規(guī)dNTPs濃度為每種核苷酸0.1~1.0 mM,通?梢0.2 mM起始,根據(jù)體系不同調(diào)整用量;
                                ·  低濃度(0.05~0.1 mM)可增加保真性,但會降低產(chǎn)量;
                                ·  高濃度提高產(chǎn)量,尤其是長片段PCR,但會降低保真度。
                                D. 鎂離子濃度
                                ·   對于Taq DNA聚合酶,鎂離子的最佳濃度為1.5~2.0 mM;
                                ·   最佳濃度取決于模板、緩沖液、DNA和dNTPs(每一種都有可能鰲合鎂離子);
                                ·   鎂離子濃度過低,會降低產(chǎn)量;
                                ·   鎂離子濃度過高,會增加非特異性PCR產(chǎn)物;
                                ·   優(yōu)化鎂離子濃度時,通常以0.5 mM梯度遞增,最高到4 mM。
                                E. Taq DNA 聚合酶濃度
                                ·   推薦使用濃度為 1~2.5 U/50 μl反應(yīng)體系。
                                F. 起始反應(yīng)
                                ·   在冰上配制反應(yīng)體系;
                                ·   最后加聚合酶;
                                ·   將熱循環(huán)儀預(yù)熱至變性溫度(94℃)后,放入PCR管,立即進行反應(yīng)。
                                G. 變性溫度與時間
                                ·   通常于94℃初始變性,使DNA雙鏈完全打開;
                                ·   變性時間通常為15~30秒;
                                ·   避免長時間或高溫度孵育;
                                ·   高GC含量模板可提高變性溫度至98℃。
                                H. 退火溫度與時間
                                ·   通常情況下,退火溫度為引物Tm值減5℃,在55~60℃之間;
                                ·   提高退火溫度有利于減少非特異性條帶;
                                ·   常規(guī)退火時間為15~30秒。
                                I. 延伸溫度與時間
                                ·   延伸反應(yīng)通常在72℃下進行。
                                ·   Taq酶的延伸時間大約為15~30秒/kb DNA;
                                ·    產(chǎn)物小于1 kb時,建議延伸時間為30~60秒;
                                ·    產(chǎn)物大于3 kb或反應(yīng)超過30個循環(huán)時,可能需要更長的延伸時間。
                                 
                                典型的循環(huán)條件:
                                預(yù)變形94℃ 2 分鐘
                                94℃ 30秒,
                                55℃ 30秒,
                                72℃ 1分鐘/1 kb,25~30個循環(huán)
                                72℃ 5分鐘
                                 
                                注:上述反應(yīng)條件適用于普通Taq DNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)。當DNA模板富含GC、具有復雜二級結(jié)構(gòu)、低濃度或產(chǎn)物>5 kb時可能需要改變相應(yīng)條件。
                                來源:北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司
                                聯(lián)系電話:400-666-3332
                                E-mail:yan.zhang@gene-star.com

                                標簽: PCR 優(yōu)化
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