鹽酸莫西沙星注射液中雜質的檢測及結構鑒定
鹽酸莫西沙星注射液中雜質的檢測及結構鑒定
王志英
沃特世科技(上海)有限公司
前言：
莫西沙星(Moxifloxacin)為人工合成的喹諾酮類抗菌藥，是一類較新的合成抗菌藥。具有抗菌性強、抗菌譜廣、不易產生耐藥性，并對常見耐藥菌有效、半 衰 期 長、不良 反 應 少 等 優(yōu) 點。臨 床 上 用 于 治 療 呼 吸 系 統(tǒng) 感 染 、生 殖系統(tǒng)感染、皮膚軟組織感染等。莫西沙星原研廠家為德國拜耳，其注射劑在中國的專利保護期即將到期，國內也有多個廠家正在進行莫西沙星的仿制。但如今基于藥品安全的考慮，仿制藥中的有關物質的檢測越發(fā)引起注意，中國藥典上也明確規(guī)定，藥物中雜質，含量高于0.1%的所有雜質均需對其雜質結構進行鑒別(毒性藥物限度則更低)。所 以 ，如 何 高 效 快 速 地 測定藥物中的雜質，這一課題逐漸成為藥物研究過程中亟待解決的難點。
本文采用沃特世(Waters®)超高效液相色譜飛行時間質譜(ACQUITY UPLC/Xevo G2-S QTof)聯(lián)用技術對莫西沙星注射液(光照10天)樣品中雜質進行分析,采用亞2 µm色譜柱UPLC方 法 ，使 整 個 分 離 時 間 由60分鐘縮短至25分鐘 ，且 雜 質 得 到 有 效 分 離 ；應 用MassLynx和MetaboLynx軟 件 ，自 動 得 到 包 含各個雜質分子量、分子式、及結構信息的雜質列表，使整個雜質鑒定過程高效快速、節(jié)省人力。
實驗條件：
實驗流程：
結果和討論：
使用方法轉換器及色譜柱選擇卡，將客戶提供的HPLC普通液相平行轉化為UPLC方法，如表1。圖3為客戶使用HPLC得到的紫外譜圖，圖4為轉化為亞2 μm色譜柱后得到的紫外譜圖。從結果可看出，分析時間由60分鐘縮短至25分鐘，流速由1.0 mL/min降低到0.45 mL/min，使用UPLC可提高效率、大大節(jié)省成本；同時，從譜圖的分離度及響應來看，UPLC的分離度更好，響應更高(進樣量由5 μL降為1 μL)。其中譜圖中紅色箭頭處幾個大峰為我們特別關注的雜質。
圖3. 客戶使用HPLC得到的紫外譜圖
圖4. 轉化為亞2 μm色譜柱后得到的紫外譜圖
與液相紫外相連的為Xevo G2-S QTof質譜，采用MSE這種簡單實用的專利技術采集樣品，可以實現(xiàn)樣品進樣一次同時得到一級質譜圖和豐富的離子碎片信息，其中包括了母離子掃描、子離子掃描和中性丟失掃描的結果，并且避免了雜質信號的丟失。如圖5為一針進樣同時得到莫西沙星注射液(光照10天)樣品的一級質譜總離子流圖、二級質譜總離子流圖。圖6為主峰的一級和二級質譜圖。
圖5. 一針進樣即可得到莫西沙星注射液(光照10
天)樣品的一級質譜及二級質譜總離子流圖
采用MassLynx軟件，通過準確的質量數(shù)和同位素匹配確定分子式，之后再根據二級碎片質譜對結構進行確認。以主峰為例說明判斷分子式的過程，如圖7確認分子式。再通過軟件MassFragment功能對二級碎片進行自動解析，如圖8，可看出，其碎片的精確度也非常好，質量偏差很小。
圖7. 通過準確的質量數(shù)和同位素分布來確定分子式(以主峰為例）
圖8. 通過準確的質量數(shù)和同位素分布來確定分子式
使用MetaboLynx對雜質進行自動解析，其解析結果界面如圖9，可以自動得到雜質列表，其中包含分子量、分子式、質量偏差、峰面積及其結構信息。軟件還自動顯示每個雜質在樣品中的提取離子流圖、在空白中的提取離子流圖、一級質譜圖和二級質譜圖，使雜質的分析更明確。通過此軟件可快速得到其整個樣品譜圖上所有雜質的信息，具體如圖10顯示。其中從“質量偏差(mDa)”可看出由Xevo G2-S QTof可獲得很好的質量精度，其質量偏差在0.8 mDa以內�！半s質與母藥關系”一欄，可快速獲得其結構的相關信息。如寫“Hydroxylation”即“主峰的結構+O”，“Hydroxylation + desaturation ”即“主峰的結構+O-H2”。另外出現(xiàn)如(R_0:-CH2)等“R_”的形式是指軟件自動對主峰進行烷基化斷裂后的結構(軟件已自動給出結構)，如“Hydration-CH2 (R_0:-CH2)”即指“主峰-CH2后的結構再+H2O-CH2”，其結構也已呼之欲出。
圖9. MetaboLynx對雜質進行自動解析的界面
圖10. 通過軟件自動得到的莫西沙星注射液(光照10天)樣品雜質列表，包含雜質峰m/z、保留時
間、分子量、分子式、質量偏差、峰面積及具體的結構信息等
客戶特別關心的三個大峰紫外譜圖中5.93 min、8.60 min、18.68 min的雜質信息如表2。其中5.93 min和8.60 min的峰包含有多個雜質，未完全分開。從圖11中，RT 5.93 min的一級質譜圖可看出：m/z 187.5981為帶了雙電荷的分子離子，與m/z 374.1880為同一化合物,且m/z 374.1880的含量較高。圖12可以看出，200.5981為帶了雙電荷的分子離子，與400.1866為同一化合物，此雜質濃度較高。圖11、12、13分別列出了這三個色譜峰的一級質譜圖、每個雜質組分的二級質譜圖及可能的結構。
圖11. 紫外譜圖中RT 5.93 min峰包含的雜質一級及二級質譜圖及可能結構
圖12. 紫外譜圖中RT 8.60 min峰包含的雜質一級及二級質譜圖及可能結構
圖13. 紫外譜圖中RT 18.68 min峰包含的雜質一級及二級質譜圖及可能結構
結論：
本實驗將常規(guī)HPLC色譜柱檢測方法平行轉化為亞2 μm的UPLC色譜柱檢測，分析時間由60 min縮短至25 min，大大提高分析效率，同時流速由1 mL/min降至0.45 mL/min，節(jié)約了溶劑成本。分離度及出峰情況與原譜圖保持一致。應用Xevo G2-S QTof能得到最準確的分子量,其雜質質量偏差在0.8 mDa以內，同時利用MeteboLynx智能軟件，快速得到包含所有雜質峰m/z、保留時間、分子量、分子式、質量偏差、峰面積及具體結構信息的雜質列表，提取離子流圖、一級和二級質譜圖等信息，大大節(jié)省人力及時間。通過此雜質列表及質譜圖可得到雜質的可能結構，再通過MassFragment功能對雜質二級碎片結構進行匹配進而確定雜質結構。從此推斷流程可看出，在高效的UPLC、精準的QTof儀器及強大的智能軟件幫助下，復雜的雜質結構鑒定工作變得更簡單輕松，對人員的經驗、資歷背景依賴性降低，大大節(jié)省人力、物力和時間成本，對于藥物的有關物質研究工作起到積極的推動作用。
