鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）說(shuō)明書

一、 簡(jiǎn)介 

金屬螯合親和層析介質(zhì)，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過(guò)渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，F(xiàn)e3+發(fā)生特殊的相互作用，能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的。因此，偶聯(lián)這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個(gè)組氨酸的蛋白以及對(duì)金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結(jié)合，但這種結(jié)合力要遠(yuǎn)小于組氨酸殘基與金屬離子的結(jié)合力。 

鎳NTA親和層析介質(zhì)（Ni-NTA ）具有特異性好、流速快的優(yōu)點(diǎn)，顆粒粒度均勻，粒徑小，并且螯合鎳更穩(wěn)定，能耐受更高的還原劑，物理和化學(xué)穩(wěn)定性好，批次重復(fù)性好。本產(chǎn)品已經(jīng)螯合好鎳離子，使用更方便。 

二、 性能參數(shù)： 

 

特點(diǎn)	基團(tuán)密度高，載量大，分辨率高，使用方便
基質(zhì)	6%的交聯(lián)瓊脂糖凝膠
配體	Ni2+
配體密度	20-40μmol /ml
吸附載量	15mg蛋白/ml
介質(zhì)顆粒大小	45-165μm
最大流速	600cm/h
pH范圍	3-10，在位清洗時(shí)pH范圍可到2-11
保存溫度	+4-8℃
保存液體	20%乙醇

 

三、 適用范圍 

分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白及能被金屬離子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。 

四、 應(yīng)用實(shí)例 

實(shí)驗(yàn)名稱：Ni-NTA 分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白 

實(shí)驗(yàn)步驟： 

 1、Ni-NTA 裝柱，1.6×20cm，柱床體積為10ml； 

 2、用緩沖液1平衡2~5個(gè)床體積，流速為2ml/min；

 3、將20ml細(xì)胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm濾膜過(guò)濾，上樣，流速為1ml/min；

 4、用緩沖液1再洗2~5個(gè)床體積，流速為2ml/min； 

 5、用分別含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的緩沖液3進(jìn)行階段洗脫，流速為2ml/min，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的分子量大小和純度； 

6、用純水流洗5個(gè)柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個(gè)柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+4-8℃環(huán)境中保存。 

緩沖液組成： 

緩沖液1：50mM pH7.4的PBS緩沖液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g, 加適量水溶解后定容到1000ml。 

緩沖液2：50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加適量，水調(diào)pH后定容到1000ml。 

緩沖液3：不同咪唑濃度的緩沖液B配制： 

 

咪唑濃度	緩沖液1量(ml)	緩沖液2量(ml)
10 mM	98	2
20 mM	96	4
50 mM	90	10
100 mM	80	20
200 mM	60	40
300mM	40	60
400 mM	20	80

SDS-PAGE流程：

 

1、BCA法測(cè)量樣品蛋白濃度 

2、根據(jù)測(cè)定樣品的蛋白濃度，算出5~10μg/孔所需的體積。 

3、向1.5ml EP管中加入含5~10μg蛋白的樣品溶液，若體積小于10μl，則加20mM PBS pH7.4補(bǔ)足10μl；若體積大于10μl，則要加入1ml無(wú)水乙醇，－20℃下濃縮1h。 

4、取濃縮樣品10000rpm離心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除殘余的乙醇。 

5、在樣品加入20mM PBS pH7.4和2×loading buffer各10μl，100℃下10min。取出后冷卻30s，4000rpm離心1s。 

6、點(diǎn)樣，電泳。 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 

 （1）使用Ni-NTA Agarose純化His標(biāo)簽重組蛋白 

His標(biāo)簽重組蛋白的上樣量為20ml，用分別含20、50、100、200、300、400mM咪唑的緩沖液B進(jìn)行洗脫，色譜結(jié)果見圖1，色譜各組分的SDS-PAGE結(jié)果見圖2。 

 

圖1. Ni-NTA Agarose純化帶His標(biāo)簽重組蛋白色譜圖

 

 

圖2. SDS-PAGE 圖譜

1、 標(biāo)準(zhǔn)蛋白，   2、上樣液，   3、流穿液，   4：20mM洗脫液，   5：50mM洗脫液，

6：100mM洗脫液，    7：200mM洗脫液，    8：300mM洗脫液，    9：400mM洗脫液。 

（2）使用Ni-NTA Agarose純化His標(biāo)簽重組蛋白包涵體 

條件和前面的方法基本相同，只是緩沖液中加了8M的脲，溶液配方如下表，其純化色譜圖和電泳圖分見圖3、圖4。 

要注意的是不同的包涵體溶解度不同，也可以用6M鹽酸胍代替8M脲，因?yàn)辂}酸胍溶解包涵體更完全。 

緩沖液組成： 

緩沖液1：50mM pH7.4的PBS緩沖液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g 和脲480 g，加熱溶解后定容到1000ml。 

緩沖液2：50mMpH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，

NaCl 29.3g，咪唑34g和脲480 g，加熱溶解后定容到1000ml。 

緩沖液3：不同咪唑濃度的緩沖液B配制： 

咪唑濃度	緩沖液1量(ml)	緩沖液2量(ml)
50 mM	90	10
400 mM	20	80

 

 

圖3. Ni-NTA Agarose純化His標(biāo)簽重組蛋白包涵體色譜圖

 

圖4.SDS-PAGE圖

1：包涵體，2：流穿液，3：50mM咪唑洗脫液，4：400mM咪唑洗脫液。 

（3）不同金屬離子及洗脫條件對(duì)純化效果的影響 

使用Ni-NTA Agarose，His標(biāo)簽重組蛋白的上樣量為10ml，用含有20、50、100、200、500mM咪唑的緩沖液3洗脫，緩沖液1和2均加入終濃度為1%的吐溫80，其結(jié)果表明加入表面活性劑可以降低雜吸附。此外分別螯合銅鈷金屬離子做同樣的純化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在回收率和純度上都以螯合鎳離子的效果最好，其分離純化的純度可以＞90%，而目標(biāo)蛋白的回收率高達(dá)80%，所以建議首選鎳離子螯合填料，別的可以不用考慮。 

五、 應(yīng)用注意事項(xiàng)： 

鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)最經(jīng)典的配體是IDA。鎳離子有六個(gè)螯合價(jià)數(shù)，Ni-IDA螯合了三價(jià)，剩余三價(jià)；而Ni-NTA螯合四價(jià)，剩余兩價(jià)，因此Ni-IDA瓊脂糖凝膠作用力要比Ni-NTA瓊脂糖凝膠的強(qiáng)。也正因?yàn)檫@個(gè)原因，在同樣條件下Ni-IDA洗雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白的要比Ni-NTA的咪唑濃度高，但是NTA的填料更穩(wěn)定，耐受更強(qiáng)的還原劑，更不容易脫落；而IDA的載量要比NTA高，可以反復(fù)利用，更加經(jīng)濟(jì)。具體用哪個(gè)填料完全看個(gè)人的習(xí)慣以及純化的條件而決定。 

六、有關(guān)操作說(shuō)明

1、色譜柱裝填 

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。 

（2）在柱下端加入蒸餾水，以除去柱中空氣，關(guān)閉柱出口，在柱內(nèi)保留少量蒸餾水。 

（3）將介質(zhì)連續(xù)倒入柱子時(shí)，要用玻璃棒緊靠柱子內(nèi)壁引流，以減少氣泡的產(chǎn)生，讓介質(zhì)自然沉降。 

（4）柱壓不超過(guò)0.3MPa，如果裝柱系統(tǒng)中無(wú)法測(cè)柱壓，則控制流速高于300cm/h，但是在使用中一般只用最大流速的75%。 

2、固定金屬離子 

（1）金屬離子的固定必須用過(guò)濾好的金屬離子溶液，以防止金屬鹽在介質(zhì)上沉淀。 

（2）用2-5倍柱床體積的蒸餾水充分平衡柱子。 

（3）選擇合適的金屬離子（Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，F(xiàn)e3+等），溶解在中性或弱酸性的溶液中，濃度為0.1~0.3M。如果是Fe3+必須在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe3+產(chǎn)生沉淀。 

（4）用2-5個(gè)柱床體積的金屬離子溶液上柱，再用不少于5倍柱床體積的蒸餾水洗滌色譜柱，洗去未螯合的金屬離子。（當(dāng)然也可以把洗凈沒(méi)有螯合的填料直接和需要的金屬離子溶液在搖床上震蕩過(guò)夜，這樣螯合效果更好，Ni-NTA Agarose尤其適合用這樣的方法。） 

（5）用2-5倍柱床體積的起始緩沖溶液平衡柱子，再上樣。 

（6）如果是螯合鐵離子，要注意的是在中性條件下，F(xiàn)e3+很容易被還原而生成沉淀，所以Fe3+溶液的pH最好是3-5。螯合Fe3+的色譜柱不能長(zhǎng)時(shí)間保存在中性溶液中。建議每次用完后都要將螯合的Fe3+用50 mMEDTA溶液洗凈，下次使用時(shí)再重新螯合。如果洗不干凈，也可以將介質(zhì)浸在50mM的EDTA中過(guò)夜后再清洗保存。 

3、上樣 

（1）樣品通溶解在pH5.5~8.5的緩沖液中，提高上樣緩沖液的pH值，可以增大載量。 

（2）選擇起始緩沖液，主要是依據(jù)金屬離子的特性及樣品與金屬離子的結(jié)合特性。 

（3）緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽，也最好不含巰基乙醇等還原劑。 

（4）常用緩沖液有10~20m M磷酸鈉鹽緩沖液和50mM醋酸鈉緩沖液 

（5）在緩沖液中要加入0.15~0.5M的NaCl，以消除離子交換作用。 

（6）使用金屬螯合層析有一個(gè)通常的法則，如果不了解蛋白的結(jié)合特性，建議先選用Zn2+，緩沖液可以選擇中性的磷酸鹽或者醋酸鹽緩沖液，NaCl的含量為0.15-0.5M，作為起始緩沖液。 

（7）緩沖液中的去污劑一般不會(huì)影響對(duì)蛋白的吸附作用。 

（8）蛋白被吸附時(shí)，經(jīng)常會(huì)有一部分的螯合金屬離子被替換，這種現(xiàn)象通常是可見的，尤其是使用有色的金屬離子時(shí)，比如Cu2+，所以使用幾次后可以先把金屬離子洗下來(lái)，然后再重新螯合金屬離子。 

4、洗脫 

（1）線性降低或一步降低pH，大多數(shù)蛋白在pH6~4會(huì)被洗脫下來(lái)，也可以在pH3~4，緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸、磷酸鹽緩沖體系。 

（2）競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：線性增加或一步增加與金屬離子有親和力的物質(zhì)，如0~0.5M咪唑，0~50 mM組氨酸，0~2M NH4Cl。梯度洗脫最好在起始緩沖液的恒定pH下進(jìn)行。 

（3）EDTA、EGTA等螯合劑會(huì)與金屬離子產(chǎn)生作用力，導(dǎo)致蛋白被洗脫下來(lái)，這種方法不能使不同的蛋白分離，此外會(huì)影響蛋白吸附，導(dǎo)致融合蛋白不能掛柱。 

（4）所有上述情況中，緩沖液中必須加入0.15~0.5M的NaCl 以消除離子交換作用。 

（5）當(dāng)螯合離子配基是Cu2+時(shí)，有以下的三種操作方式： 

降低pH： 

上樣緩沖液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 7.4 

洗脫緩沖液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 3.5 

競(jìng)爭(zhēng)洗脫： 

上樣緩沖液：50 mM Na2HPO4， 1M NaCl， pH 7.4 

洗脫緩沖液：50 mM Na2HPO4， 1M NH4Cl， pH 7.4 

脫落洗脫： 

上樣緩沖液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 7.4 

洗脫緩沖液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4 

使用降低pH和脫落洗脫都會(huì)使金屬離子掉下來(lái)，下次使用就得重新螯合金屬離子。

七、 再生、清洗、保存 

1、凝膠的再生 

（1）螯合一種新的金屬離子之前，必須將膠再生。用5~10倍體積的50mM EDTA淋洗柱子，再用2~3倍體積的0.5M NaCl洗掉殘留的EDTA。 

（2）金屬離子的重新固定的方法如前文所述。在一些操作中，變性蛋白和脂質(zhì)不能在柱子的再生過(guò)程中被洗脫下來(lái)，他們可以通過(guò)在位清洗被除去。 

2、在位清洗 

（1）除去因離子交換作用吸附的蛋白，用2~3倍柱床體積2M NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗。 

（2）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，用1M NaOH以100cm/h的速度淋洗柱子1h。 

（3）所有操作中，都要用至少3倍柱床體積的初始緩沖液洗柱子。 

（4）除去強(qiáng)的疏水性蛋白和脂質(zhì)等，用4倍柱床體積的70%的乙醇或者30%的異丙醇洗柱子，再反向淋洗。 

八、保存 

在20%乙醇中，4℃下長(zhǎng)期保存。