數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用簡介
更靈敏，更特異，更精確
——數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用簡介
數(shù)字PCR技術(shù)的原理
數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用絕對定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到廣泛的應(yīng)用，這項技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。
數(shù)字PCR采用的策略概括起來非常簡單，就是“分而治之”（divide and conquer）［1］，這種做法非常類似于計算機科學(xué)中的“分治算法”，將一個標準PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個反應(yīng)器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板) ，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”，擴增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標序列的拷貝數(shù)。在實際的數(shù)字PCR實驗中，事實上是通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反應(yīng)器比例和數(shù)目進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。
圖1. 數(shù)字PCR的原理（圖片來源http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/pcr/digital-pcr.html）
數(shù)字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進行結(jié)果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實驗中標準反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。
數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展歷史
從以上介紹我們可以看到，事實上數(shù)字PCR與傳統(tǒng)的定量PCR兩者皆定位于同樣的平臺基礎(chǔ)——聚合酶鏈式反應(yīng)和雙鏈DNA標記技術(shù)，但兩者采用的是完全不同的定量策略和思想方法， dPCR和qPCR并沒有實驗方法和思路上的承繼關(guān)系，從這個角度來說，目前很多人把數(shù)字PCR稱為第三代PCR技術(shù)并不準確。
在實時定量PCR技術(shù)成熟和發(fā)展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯醫(yī)學(xué)中心的科學(xué)家使用有限稀釋、PCR和泊松分布數(shù)據(jù)校正模型的方法（ limiting dilution, PCR and Poisson statistics），檢測了復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因，進行了極其精細的定量研究［2］，雖然當時這種方法并沒有被冠以“數(shù)字PCR”之名，但已經(jīng)建立了數(shù)字PCR基本的實驗流程，更重要的是了數(shù)字PCR檢測中一個極其重要的原則——以“終點信號的有或無”（all-or-none end point ）作為判斷標志，這也是之后1999年Bert Vogelstein 和 Ken Kinzler將之命名為“數(shù)字PCR”(digital PCR)的主要原因［3］。
數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類似流式技術(shù)的磁珠乳液擴增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了第一臺商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國 Inostics 推出基于磁珠法乳濁液擴增和流式檢測方式的BEAMing dPCR 檢測服務(wù)，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無法達到更加精細的要求，時間和耗材成本嚴重限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。
近幾年來，隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)（nanofabrication and microfluidics）的發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)遇到了突破技術(shù)瓶頸的最佳契機。1997年Kalinina, Brown J, 和Silver J使用納升級芯片進行單克隆模板PCR擴增，獲得了美國專利，更重要的是這種采用“電浸潤法”進行納升級芯片制造技術(shù)顯露雛形［4］。伴隨二代測序技術(shù)發(fā)展起來的“油包水PCR”技術(shù)，可以一次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，可以作為dPCR的樣品分散載體。
QuantaLife 利用油包水微滴生成技術(shù)開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，這也是最早出現(xiàn)的相對成熟的數(shù)字PCR平臺，在運行成本和實驗結(jié)果穩(wěn)定性方面都基本達到了商品化的標準。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號儀繼續(xù)在市場上銷售，這個早期型號為dPCR概念的普及和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級型號QX200。
2012年，RainDance公司推出Raindrop型號數(shù)字PCR設(shè)備，這個設(shè)備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術(shù)平移到數(shù)字PCR技術(shù)平臺，在高壓氣體驅(qū)動下，將每個標準反應(yīng)體系分割成包含100萬至1000萬個皮升級別微滴的反應(yīng)乳液， 該公司的創(chuàng)始人之一Darren Link表示這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶“提供更高的檢測動態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品”［1］。
2013年下半年，Life-technologies推出了，這也是目前數(shù)字PCR市場上最新型號的產(chǎn)品。采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣本均勻分配至20,000個單獨的反應(yīng)孔中。在整個工作流程中，樣本之間保持完全隔離 ，可以有效地防止樣品交叉污染，減少移液過程，簡化操作步驟。同時芯片式設(shè)計避免了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問題［5］。
作為Life-technologies在OpenArray芯片平臺之外推出的全新的芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，值得一提的是，這個全新的系統(tǒng)在設(shè)計理念上綜合考慮了系統(tǒng)穩(wěn)定性與運行成本因素，直接反映了該系統(tǒng)“適合所有分子生物學(xué)實驗室使用的數(shù)字PCR系統(tǒng)”的市場定位。
數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域
從上世紀90年代以來qPCR技術(shù)的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測技術(shù)具有全新的面貌，而進入二十一世紀之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測序技術(shù)正在迅速發(fā)展，也是目前競爭最為激烈的研究領(lǐng)域之一，即使在這種情況下，dPCR技術(shù)仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學(xué)領(lǐng)域爭取到屬于自己的一席之地。即使在一些傳統(tǒng)的qPCR應(yīng)用領(lǐng)域，也有一些實驗室同時選擇dPCR平臺進行平行實驗以保證實驗結(jié)果的準確和可重復(fù)性［5］。
在基因組變異研究領(lǐng)域，群體基因組水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測面臨的問題主要是突變序列往往與大量正常序列同時存在，競爭性反應(yīng)嚴重影響突變序列的檢測精度，數(shù)字PCR技術(shù)帶來的極高的擴增特異性在稀有突變檢測方面具有天然的優(yōu)勢，在癌癥標志物檢測、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查、線粒體突變檢測等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。
CNV（Copy Number Variations，拷貝數(shù)變異）研究需要極高的定量精度以區(qū)別不同拷貝數(shù)之間的微小差異，測序方法適用于高于30%的變異率檢測，而qPCR的最高分辨在1.5倍左右，數(shù)字PCR通過直接計數(shù)目標基因與參照基因( 拷貝數(shù)為1的基因，例如RNaseP) 的數(shù)目，計算比值，直接得到目標基因的拷貝數(shù)可以達到極高的拷貝數(shù)分辨精度［5］。
除此之外，dPCR在病原微生物檢測、microRNA研究、基因表達研究、NGS測序文庫的絕對定量、表觀遺傳學(xué)直接相關(guān)的DNA甲基化定量檢測、ChIP定量鑒定等領(lǐng)域的應(yīng)用都令人極為期待，而在轉(zhuǎn)基因成分鑒定、分子標準品精確定量、環(huán)境樣本檢測等具體的應(yīng)用方向上，已經(jīng)有大量實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果證明了dPCR技術(shù)的優(yōu)良性能。
與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數(shù)字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數(shù)字PCR的應(yīng)用前景時，更應(yīng)該保持一種開放的心態(tài)，與其說數(shù)字PCR技術(shù)是一個新的檢測平臺，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。
參考文獻：
1. M Baker nature methods |VOL.9 NO.6 |JUNE 2012 | 541-544.
2. Sykes, P.J. et al. Biotechniques 13, 444–449 (1992).
3. Vogelstein, B. & Kinzler, K.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9236–9241 (1999).
4. Kalinina, O; Brown J, Silver J (1997). Nucleic Acids Research 25 (10): 1999–2004.
5. V Marx nature methods |VOL.11 NO.3 |MARCH 2014 | 241-245.
來源：賽默飛世爾科技（Life Technologies）
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