在熒光應(yīng)用中使用激光作為照明光源需要特別注意光路的問(wèn)題。需要特別注意的地方集中在光的相干性、小的光束直徑、光偏振以及光功率。在一些情形下，錐體角(入射角)、系統(tǒng)中存在的散射都是在光路設(shè)計(jì)中需要考慮的重要影響因素。雖然光路設(shè)計(jì)中需要對(duì)整個(gè)光路考慮周全，但這篇文章將著重講解在光路中使用到的濾光片和分光鏡。

在經(jīng)典的仰角位置光照配置中有3種光件扮演著重要角色，分別是：激發(fā)片，二向色鏡/分光鏡、發(fā)射片。通常這些鏡片被安裝在一個(gè)立方盒底座上，這個(gè)底座可以根據(jù)需要插入或者從顯微鏡上移除。

在這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微鏡范例中，激發(fā)片可以阻斷所有從深紫外到近紅外波段的非熒光染料激發(fā)波段的光。通常這是一個(gè)具有30到60納米半峰全寬(FWHM)的帶通濾光片。在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡中，這些鏡片沒(méi)有表面平整度規(guī)格或透射波陣面的要求。楔可以很大(通常是少于8弧分)，劃痕/戳的規(guī)格最小是80/50。可以有小到無(wú)法衡量或觀察不到的針孔。通常這里不用過(guò)分擔(dān)心樣品自發(fā)熒光的問(wèn)題，因?yàn)檫@個(gè)鏡片被放置在成像路徑之外。這個(gè)鏡片通常來(lái)講不是增透鍍膜的并且采用浮法玻璃作為基片。這些激發(fā)片都是零度入射角設(shè)計(jì)的。

與epi平臺(tái)相比，激光系統(tǒng)盡管大多數(shù)使用的還是上面列出的三種鏡片但是他們的配置差異極大。這些濾光片和鏡片通常并一定安裝在一個(gè)底座/立方盒上，它們?cè)诠饴分械奈恢靡彩歉鶕?jù)系統(tǒng)的不同而變化。

在激光的應(yīng)用中，大多數(shù)濾鏡的規(guī)格要求有明顯不同。純化濾光片(用于激光的激發(fā)片)必須僅對(duì)來(lái)自激光的不需要的波段有過(guò)濾作用�，F(xiàn)在還有很多用戶認(rèn)為激光不需要純化濾光片，這不是正確的。幾乎所有的等離子體激光器會(huì)產(chǎn)生多條不同功率的譜線，并且新一代的二極管發(fā)射譜具有更寬的半峰全寬。此外，它們也可能會(huì)有遠(yuǎn)離主要譜線的噪聲。二極管泵浦固態(tài)激光器在它們的輸出中通常會(huì)有非常窄發(fā)射譜，但是它有可能被泵浦源或主要譜線所污染。由于這些原因，所有的激光系統(tǒng)都要進(jìn)行有或沒(méi)有純化濾光片時(shí)的信噪比檢測(cè)。透射波陣面必須優(yōu)于每英寸一個(gè)波，盡管有些應(yīng)用中的要求是每英寸1/4個(gè)波或者更好。楔必須小，一個(gè)弧分以內(nèi)，且沒(méi)有針孔。必須事先考慮到樣品的自發(fā)熒光，并且必須劃痕/戳的規(guī)格不低于60/40。這些濾鏡通常具有10-20納米的半峰全寬，是經(jīng)打磨和拋光過(guò)的，并且在任一面都是增透鍍膜，而不是干涉鍍膜。盡管標(biāo)準(zhǔn)的激光應(yīng)用使用浮法玻璃作為基片效果非常好，拉曼技術(shù)以及其它的應(yīng)用可能需要用熔融石英玻璃來(lái)消減光路中可能存在的任何自發(fā)熒光的。純化濾光片被設(shè)計(jì)成適合于3-5度的入射角以確保反射的激光不會(huì)回到激光震蕩腔中。如下圖1。



配置中的第二種鏡片是二向色鏡，也叫做分光鏡，在廣義的epi系統(tǒng)中它通常會(huì)有如下規(guī)格：少于每英寸10波的表面平面度，少于每英寸1個(gè)波的透射波陣面，少于或等于一弧分的楔，40/40的劃痕/挖痕。二向色鏡應(yīng)該用熔融石英玻璃制成，因?yàn)樗�被放�?/SPAN>epi系統(tǒng)的激發(fā)路徑和反射路徑中。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用，這種鏡片不需要是增透鏡片。這些鏡片被設(shè)計(jì)成長(zhǎng)通濾光片(反射短波光而透射長(zhǎng)波光)或者短通濾光片(透射短波光而反射長(zhǎng)波光)。在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡配置中二向色鏡被設(shè)計(jì)成45度的入射角從而使得激發(fā)光的角度改變90度。

在激光應(yīng)用中，分色鏡有更嚴(yán)格的規(guī)范要求：在鍍膜之前有小于每英寸1/2個(gè)波的表面平面度，小于1/4個(gè)波的透射波面畸變，小于5弧秒的楔，以及通常為40/20的劃痕/挖痕。所有的激光鏡片都需要增透鍍膜以減少激光的二次反射和散射，同時(shí)增強(qiáng)透射。大多數(shù)商業(yè)用的顯微鏡號(hào)稱是1毫米厚的二向色鏡，這就要使用較厚的熔融石英玻璃才能更容易滿足這些要求。由于以上原因，激光應(yīng)用系統(tǒng)常常會(huì)使用較厚的鏡片/二向色鏡。當(dāng)大多數(shù)的激光鏡片被設(shè)計(jì)成45度入射角時(shí)，一些當(dāng)前流行的甚至更新版本的共焦顯微鏡使用10-15度入射角鏡片來(lái)增加反射率(即增加阻塞)以及使偏振影響最小化。所有以上的規(guī)范都被認(rèn)為是最低限度的要求，因?yàn)樵谀承��?yīng)用中還要求這些鏡片達(dá)到更高的標(biāo)準(zhǔn)。

二向色鏡需要考慮的另外一個(gè)因素是激光的偏振。鏡片的設(shè)計(jì)要求在零度入射角下沒(méi)有偏振，但是任何一個(gè)鏡片在一定的入射角下都有著起偏器的作用，入射的角度取決于具體的設(shè)計(jì)。因此，所有激光鏡片都需要考慮激光的偏振性質(zhì)。見(jiàn)圖2。


對(duì)于分色鏡需要考慮的另一個(gè)要素是在任何基片例如熔融石英玻璃上鍍膜都會(huì)產(chǎn)生應(yīng)力。這種應(yīng)力可能很小以至于不易察覺(jué)，但確足以在光束中導(dǎo)致極端的散光。較厚的基片基本能夠幫助解決這個(gè)問(wèn)題，但僅僅靠它還有可能不夠。因此，多數(shù)制造商會(huì)有專門(mén)的辦法來(lái)中和這種應(yīng)力，并且這些鏡片的反射特性也要嚴(yán)格兼顧到。需要注意的是透射波陣面是依賴于基片的外表面的平整度，通常不受任何涂層的影響。

導(dǎo)致產(chǎn)生應(yīng)力的另外一個(gè)可能原因是安裝該鏡片到系統(tǒng)中的方法。放置該鏡片的45度卡座的表面應(yīng)該被拋光得類似于基片的表面平整度(例如每英寸1/2個(gè)波)，并且任何支撐該鏡片在其位置上的物體不能產(chǎn)生任何不均的壓力。這些影響在TIRF(全內(nèi)反射顯微鏡)中是最明顯的，并且可能會(huì)要求用一個(gè)完全定制的的立方體底座來(lái)代替標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡底座。

發(fā)射片是配置當(dāng)中的最后一種鏡片了，也經(jīng)常被叫做隔紫外濾光片。該鏡片的主要功能是阻止激發(fā)波段光到達(dá)探測(cè)器(人的眼睛或是電子探測(cè)設(shè)備)。它的第二個(gè)功能是透射來(lái)自目標(biāo)染料的所需熒光。這就意味著發(fā)射片必須高消光阻塞任何透過(guò)激發(fā)片的光。阻塞通常是用光密度(OD)來(lái)衡量，它是透過(guò)率(T)的對(duì)數(shù)，在廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域它的取值范圍在OD 3到OD 6之間。這種鏡片要么是帶通的，要么是長(zhǎng)通的，其典型的規(guī)格要求為：小于每英寸1波的波陣面，小于一弧分的楔，60/40的劃痕/挖痕。增透鍍膜可以根據(jù)特殊的應(yīng)用進(jìn)行選擇。

對(duì)于激光應(yīng)用，對(duì)發(fā)射片的最低要求就跟上面定義也很接近，除了一點(diǎn)，對(duì)激光束的阻塞應(yīng)該最小為OD 6，并且在所有的情況下都應(yīng)該使用增透鍍膜。這些發(fā)射片也被設(shè)計(jì)成0-5度的入射角，就像許多現(xiàn)代的寬場(chǎng)系統(tǒng)一樣，以減少內(nèi)部的反射。如下圖3。

標(biāo)準(zhǔn)的激光掃描共焦系統(tǒng)
典型的激光掃描單元要求滿足上面列出的規(guī)范同時(shí)還需要考慮發(fā)射片是放在轉(zhuǎn)輪中還是分流單元中。如果共聚焦顯微鏡只有一個(gè)探測(cè)器(通常是一個(gè)PMT)或使用發(fā)射片轉(zhuǎn)輪來(lái)順序成像，那么用于每一個(gè)激光束的發(fā)射片必須只能過(guò)濾那一束激光。多探測(cè)器系統(tǒng)則使用發(fā)射分光二色鏡來(lái)控制光線。這些分色鏡不需要比普通鏡片滿足更多的規(guī)格要求，但是在一些應(yīng)用中需要有增透鍍膜來(lái)保證成像質(zhì)量。

就像上面提及到的，一些新一代的激光掃描單元使用一個(gè)普通二向色鏡，其入射角不是45度而可能是10-15度，但是，分光二向色鏡通常是45度入射角。


多針孔共聚焦顯微鏡
目前的商業(yè)Nipkow Disk共聚焦顯微鏡有兩個(gè)完全不同的光束路徑。一個(gè)是使用初級(jí)的分色鏡來(lái)反射激光因此它非常類似于標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦配置。另一個(gè)類型是使用初級(jí)分色鏡來(lái)傳輸激光到樣本上，然后再反射這些激發(fā)光到探測(cè)器上(通常是CCD攝像機(jī))。多個(gè)原因都使得這類透射分色鏡的設(shè)計(jì)非常困難。二向色鏡在一定程度上更難設(shè)計(jì)和制造是因?yàn)橐�求具有非常窄的透射波段和寬的反射波段。這種設(shè)計(jì)意味著甚至多得多的激光最終會(huì)被反射到探測(cè)器上(也在不同的角度)，因此就需要特別強(qiáng)調(diào)發(fā)射片的過(guò)濾能力。由于這些透射鏡片是放置在光程的聚焦路徑中，基片的厚度是受到限制的，這使得波陣面畸變控制變得更加復(fù)雜。如圖4所示。


全內(nèi)反射熒光顯微鏡，TIRF
全內(nèi)反射熒光顯微鏡最初的設(shè)計(jì)是使用棱鏡使激光束射到細(xì)胞粘附的交界處。這樣做存在著經(jīng)常需要校準(zhǔn)的問(wèn)題，但是從濾波片的角度來(lái)看，它更直截了當(dāng)，因?yàn)楸环瓷涞募す獠粫?huì)被物鏡收集。然而，后來(lái)發(fā)展的通過(guò)鏡頭取景式的全內(nèi)反射熒光顯微鏡帶來(lái)了不一樣的環(huán)境條件，即激光激發(fā)光事實(shí)上被物鏡吸收了。因此，激光可以毫無(wú)損耗地被反射回光路中。反射光線要求全內(nèi)反射熒光顯微鏡應(yīng)用中的二向色鏡和發(fā)射片能夠處理大量的反射激光。激光會(huì)給任何往顯微鏡中看的人造成危險(xiǎn)，因此它通常被激光遮擋設(shè)備過(guò)濾掉。

就像之前提到的，全內(nèi)反射熒光鏡應(yīng)用中的二向色鏡的反射波陣面畸變(RWD)必須滿足相當(dāng)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，通常是以表面平整度為每英寸0.1波和透射波面畸變?yōu)槊坑⒋?/SPAN>0.1波的基片開(kāi)始。必須非常注意使用的鍍膜不要給基片帶來(lái)超過(guò)可接受水平以外的壓力。由于系統(tǒng)可能會(huì)變化，這項(xiàng)要求可以是在鍍膜之后每英寸0.25到1個(gè)波的表面平整度。

在全內(nèi)反射熒光顯微鏡設(shè)備中，發(fā)射片的阻塞必須大于OD 6，并且在許多應(yīng)用中甚至要達(dá)到OD 8。僅在幾年前，這還被認(rèn)為是不可能的，但由于使用了高級(jí)的鍍膜技術(shù)和非常特殊的訣竅之后，現(xiàn)在已經(jīng)是相當(dāng)普遍了。

系統(tǒng)設(shè)計(jì)造成的高角度反射使得全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像相當(dāng)復(fù)雜，因?yàn)楦缮鏋V波片都被設(shè)計(jì)成0-5度的入射角。超過(guò)了這些圓錐角的光線會(huì)使濾波片的cut-on朝向紫外方向偏移，即朝向激光源。因此，此類系統(tǒng)中的高角度激發(fā)光要求發(fā)射片具有一定的cut-on紅移來(lái)避免上述想光源的偏移效應(yīng)同時(shí)還保持完整的阻塞能力。在這種情境下的另外一個(gè)選擇是使用吸收玻璃，它不依賴于角度變化，但是能大大降低濾波片的透射率。

在目前的通過(guò)鏡頭取景式的全內(nèi)反射熒光顯微鏡系統(tǒng)中，在立方盒(底座)中或靠近鏡片二色鏡中使用發(fā)射片是非常普遍的，并且在探測(cè)器發(fā)射片轉(zhuǎn)輪前面放置第二個(gè)發(fā)射片。在立方盒中放置一個(gè)好的阻塞發(fā)射片也大大增加了安全系數(shù)，以防止某人意外地在沒(méi)有激光鎖的情況下向顯微鏡中看過(guò)去而受傷。這種雙保險(xiǎn)的發(fā)射設(shè)計(jì)在一些系統(tǒng)下是絕對(duì)有必要的，但在另外的系統(tǒng)中就不一定。這里需要說(shuō)明的是標(biāo)準(zhǔn)的非常窄的凹口濾光片在這些應(yīng)用中效果不是非常好，因?yàn)檫@種類型的濾光片對(duì)入射光的角度非常敏感。如下圖5和圖6。



多光子系統(tǒng)，三分之二激光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)
發(fā)展?jié)M足早期的理論參數(shù)的雙光子成像系統(tǒng)(通過(guò)使用高功率脈沖激光在兩杯激發(fā)波長(zhǎng)處激發(fā)熒光基團(tuán))，對(duì)于濾光片生廠商而言存在很大的技術(shù)難題。對(duì)于這些系統(tǒng)，在非掃描模式下，主要的鏡片應(yīng)該是短通設(shè)計(jì)的，即反射長(zhǎng)波長(zhǎng)的波段而透射短波長(zhǎng)的波段。這種鏡片必須被設(shè)計(jì)得反射和透射的效率都相當(dāng)高，并且保證入射的脈沖光線沒(méi)有任何的色散，因?yàn)檫@會(huì)明顯降低峰值的功率。這種新技術(shù)也意味著這些系統(tǒng)中的阻塞濾光片對(duì)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的波段有最大化的阻塞效果，而單光子激光顯微鏡恰好相反要在短波有較好的阻塞作用。全新的濾光片設(shè)計(jì)必須是長(zhǎng)時(shí)間不斷的研發(fā)和完善以滿足目前要求在全部參數(shù)調(diào)整范圍內(nèi)的激光的阻塞達(dá)到的OD 8+的水平。如下圖7。


為了深入完善濾光片的設(shè)計(jì)，許多人想使用二次諧波(SHG)成像和做3光子激發(fā)，這些都要求二向色鏡和發(fā)射片能夠透射紫外范圍的光。這可能是設(shè)計(jì)中最困難的一部分，但現(xiàn)已通過(guò)干涉技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。如圖8。

有更多的用戶使用非再掃描探測(cè)(NDD)系統(tǒng)，發(fā)射信號(hào)不通過(guò)主要的分色鏡。這些系統(tǒng)通常直接將熒光從樣本傳輸?shù)教綔y(cè)器。在光路開(kāi)始的位置(見(jiàn)圖7、圖8)，探測(cè)器或者是多探測(cè)器系統(tǒng)中的每一個(gè)探測(cè)器的前面安裝帶通發(fā)射片，可能會(huì)是一個(gè)短通發(fā)射片，來(lái)阻塞激光。這些通常被安裝在立方盒底座上以簡(jiǎn)化光束路徑。如圖9。


相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微技術(shù)

這種新技術(shù)，得到了哈佛大學(xué)謝曉亮(SunneyXie)博士的支持，是一種要求有包含多種波長(zhǎng)泵浦激光和斯克托斯激光的成熟多光子應(yīng)用。由于這些激光功率巨大，可能還需要另外的阻塞能力，可能要超過(guò)上面提到的標(biāo)準(zhǔn)雙光子系統(tǒng)中OD 8+的水平，并且連續(xù)使用兩個(gè)阻塞鏡片的情況也非常普遍。如下圖10。


拉曼光譜

拉曼技術(shù)已經(jīng)存在很多很多年了。目前最常見(jiàn)的是被應(yīng)用在關(guān)于長(zhǎng)波激光的正斯克托斯拉曼信號(hào)上(使用長(zhǎng)通二向色鏡和長(zhǎng)通發(fā)射片)。有時(shí)候，研究者更喜歡看負(fù)的斯克托斯拉曼反應(yīng)(使用短通二向色鏡和帶通或短通發(fā)射片)。每一種應(yīng)用都需要特殊的鏡片或?yàn)V光片，但是主要的要求是盡最大努力阻塞激光，因?yàn)槔�曼信�?hào)非常低。通常拉曼信號(hào)太低，所以光學(xué)鏡片包括純化濾光片和發(fā)射片必須采用熔融石英玻璃而不是浮法玻璃制作，以減少系統(tǒng)中出現(xiàn)的任何的自發(fā)熒光。此外，二向色鏡和發(fā)射片還必須被設(shè)計(jì)得盡量靠近激光束。幸運(yùn)地是，許多正的斯克托斯實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚴褂瞄L(zhǎng)通發(fā)射片，這種發(fā)射片更容易設(shè)計(jì)成離激光束只有幾毫微米，并且仍然能獲得最佳的激光過(guò)濾效果。如圖11。

激光阱和光鑷

通常，這些系統(tǒng)使用一個(gè)1064納米的激光束或者類似聚焦束照射標(biāo)本平面。為了達(dá)到這個(gè)目的，大多數(shù)的系統(tǒng)使用一個(gè)能反射近紅外光(NIR)和透射可見(jiàn)光的長(zhǎng)通分色鏡。此外，所有的發(fā)射片必須能夠阻塞激光阱，就像上面描述的類似于雙光子的阻塞。如圖12。

流式細(xì)胞術(shù)

由于流式系統(tǒng)使用激光器，即使一些規(guī)格由于這些機(jī)器固有的能力通過(guò)在其計(jì)算中使用激光光散射和激發(fā)光來(lái)消除噪音得以放寬，他們也需要特別考慮。這些系統(tǒng)不使用成像組件通常是不能成像的。流式細(xì)胞儀光學(xué)檢測(cè)技術(shù)的最大的挑戰(zhàn)之一就是從越來(lái)越多的熒光染料中同時(shí)收集信號(hào)所帶來(lái)的困難。這就意味著二向色鏡(可能是長(zhǎng)通也可能是短通，這要取決于設(shè)備的設(shè)計(jì))和發(fā)射片在相同的發(fā)射路徑中可能被設(shè)計(jì)成適合4到6種不同的熒光染料。這就迫切需要將分色鏡設(shè)計(jì)得非常陡，并且陡而窄的發(fā)射片設(shè)計(jì)還必須滿足市場(chǎng)上不同流式系統(tǒng)一般化設(shè)計(jì)的要求。完整的流細(xì)胞術(shù)應(yīng)用的內(nèi)容可以在網(wǎng)站www.chroma.com上查看。