作者：李愛麗等 來源：生物技術(shù)通報(bào)

典型的PCR操作
在此處僅列出—般PCR操作過程，具體影響因素的優(yōu)化將在本章第二節(jié)討論，每一個(gè)具體操作前都需進(jìn)行必要的優(yōu)化。
（一） 試劑
（1）引物根據(jù)待擴(kuò)增DNA不同，引物亦不同，引物的設(shè)計(jì)見本章第三節(jié)。
（2）耐熱DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來的，能耐受高溫（93—100c），
不同耐熱DNA聚合酶的特性詳見本章第4節(jié)。 Perkin—E1mer—cetus公司、
N、F、Bio1ab、PharMacia公司、國內(nèi)華美公司、復(fù)旦．大學(xué)和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院友誼公司等均有商品供應(yīng)。
（3）10x PCR緩沖液： 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl（pH8.4， 20c），
150mmol／L MgCl2， lmg／m1明膠o ““
（4）5mmo1／L dNTP貯備液：將dATP，dCTP，dGTPT和dTTP鈉鹽各100mg合
并，加3m1滅菌去離子水溶解，用NaoH調(diào)pH至中性，分裝每份300v1， （-） 20℃保存c
dNTP濃度最好用uv吸收法精確測定。另外�，F(xiàn)在已有中性dNTP溶液商品供應(yīng)
（Sigma公司和Pharmacia公司等）.
（5）標(biāo)本處理試劑：不同標(biāo)本所需試劑不同，根據(jù)具體情況而定〔見本章第6節(jié)）G
（二） 操作程序
利用PcR擴(kuò)增的操作程序基本相同，只是根據(jù)引物與靶序列的不同，選擇不同的反
應(yīng)體系與循環(huán)參數(shù)（見本章第：：節(jié)）o基本的操作是將PcR必需反應(yīng)成分加入一微量離心
管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室或每個(gè)人都有不同的操
作習(xí)慣，但需遵守一定的操作規(guī)范。我們推薦下述操作程序，因這樣操作可最大程度地增
加反應(yīng)的成功率。
（1）向一微量離心管中依次加入：
ddH2 O補(bǔ)至終體積（終體積50~100ul）
10 x PCR緩沖液 1／10體積
dNTP 各200umol／L
引物 各1umol／L
DNA模板 10*10一10*10*10*10*10拷貝
混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。
（2）加石蠟油50—100ul于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97c變性7min（染色體
DNA）或5min（質(zhì)粒DNA）.
（3）冷至延伸溫度時(shí)，加入1—5U Taq DNA聚合酶，在此溫度作用1min.
（4）于變性溫度下使模板DNA變性適當(dāng)時(shí)間。
（5）在復(fù)性溫度下使引物與模板雜交一定時(shí)間。
（6）在延伸溫度下使復(fù)性的引物延伸合適的時(shí)間。
（7）重復(fù)（4）一（6）步25—30次。每次即為一個(gè)PcR循環(huán)o
（8）微量瓊脂德凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物（見本章第7節(jié)）o
上述過程可以用PcR自動(dòng)熱循環(huán)儀進(jìn)行，也可以設(shè)定3個(gè)恒溫水浴鍋手工操作.