喬立瑞¹、Rob Lewis²、Alex Hooper²、James Morphet²、譚曉杰¹、Kate Yu³
1. 沃特世科技（上海）有限公司，上海，中國
2. 沃特世公司質譜技術中心，曼徹斯特，英國
3. 沃特世公司，馬塞諸塞州米爾福德市，美國

本應用紀要描述了如何使用沃特世（Waters®）UNIFI®天然產物整體解決方案中二元比較的工作流程快速準確的檢定來自兩個不同廠家的雙黃連口服液化學組分的異同點，從而了解同一產品不同廠家的成分差異，也有助于同一廠家監(jiān)控不同批次間產品的質量穩(wěn)定性。為所有類似的不同樣品二元比較的工作提出了簡單、有效的解決方案。

關鍵詞:
中藥產品二元比較、UNIFI中藥數(shù)據庫、UPLC®/QTof MS、UNIFI 天然產物解決方案、UNIFI 天然產物工作流程、雙黃連口服液、中藥質量監(jiān)控、產品批次比對

背景介紹:
中國的傳統(tǒng)醫(yī)藥既復雜又神奇，發(fā)展已有幾千年的歷史。但長期以來，如何判斷中藥質量的真、偽、優(yōu)、劣缺乏系統(tǒng)、科學的分析方法。比如對不同產地中藥材有效成份的控制，對不同栽培方式、不同采摘季節(jié)或不同加工炮制工藝后中藥材的質量評價等一直沒有統(tǒng)一有效的方法。近幾年來，藥學工作者在中藥質量標準研究方面做了不少工作，積累了不少寶貴的經驗和方法。但總體來說，中藥二元比較工作耗時、成本高，甚至有的方法缺少一定的科學依據，不夠充分、客觀。本應用紀要采用先進的分離檢測技術結合全新的UNIFI天然產物整體解決方案對此類應用提出了有效解決問題的思路。

不同產地藥材化學成分的異同、不同廠家同一產品的差異、同一廠家不同批次間產品的質量穩(wěn)定性等都需要對類似樣品進行比較，觀其成分異同，進而找出差異，為后期的研究提供明確的指導方向。隨著分析儀器技術的不斷進化，高分辨液質聯(lián)用儀器（比如UPLC/QTof MS）的使用在逐步推廣。高分辨液質聯(lián)用儀器可使樣品的分析時間縮短、分離效率提高，同時還有適應性、專屬性高、檢測限低、進樣量小、溶劑消耗少、自動化程度高、定性能力高等特點，在中藥質量標準控制的地位也會越來越高。

本應用紀要以兩個不同廠家的雙黃連口服液產品對比作為應用實例向大家闡述最新的沃特世UNIFI天然產物整體解決方案。該解決方案以超高效液相色譜（ACQUITY UPLC® I-Class）， 四級桿飛行時間質譜（Xevo® G2-S QTof MS）以及UNIFI中藥數(shù)據庫為基礎，采用UNIFI二元比較工作流程對類似的樣品進行比較，迅速找出差異，為后期的質量監(jiān)控和制定相關的質量標準提供依據，從而大大提高了工作效率，并減少了對操作人員技術背景的要求。

雙黃連口服液的主要藥材來源為金銀花、黃芩及連翹，具有疏風解表，清熱解毒的功效。對于上呼吸道感染、扁桃體炎、咽炎、病毒性肺炎等細菌和病毒感染性疾病有一定療效。其中黃芩苷、連翹苷、漢黃芩素是其主要活性成分。中國國內有很多廠家都生產該口服液產品。故我們借此極有代表性的實例來闡述UNIFI天然產物整體解決方案中二元比較的工作流程（圖1）。

圖1 UNIFI天然產物整體解決方案中二元比較的工作流程

實驗條件：

樣品處理：
取雙黃連口服液200 μl溶解于2 mL H2O中（相當于稀釋十倍），備用。進樣體積為1 μl。

液相色譜條件：
儀器： ACQUITY UPLC I-Class with FTN Sample Manger
色譜柱： ACQUITY UPLC HSS T3，2.1 x 100 mm 1.8 μm，40攝氏度
樣品室溫度： 15 攝氏度
流動相A： 水 （0.1% 甲酸）
流動相B： 乙腈

梯度:

質譜條件：
儀器： Xevo G2-S QTof MS
采集質量范圍： 100-1500 Da
掃描時間： 0.1 S
采集模式： ESI+和 ESI-分辨率模式，MS^E
Lock mass： 亮氨酸腦啡肽（LE） 1 ppm （0.3 S 掃描，間隔：15 S）
毛細管電壓： 3 KV （ESI+）/ 2.5 KV （ESI-）
錐孔電壓： 100V
碰撞能量（eV）： low CE： 6 /High CE： 20-45
電離源溫度： 120 攝氏度
脫溶劑溫度： 500 攝氏度
錐孔氣流速： 60 L/h
脫溶劑氣流速： 1000 L/h
數(shù)據采集時間： 15 min

結果:
采用超高效液相色譜與四級桿飛行時間質譜對兩個不同廠家雙黃連口服液的相關化學成分進行數(shù)據采集。采用UNIFI天然產物整體解決方案中二元比較工作流程并結合UNIFI中藥數(shù)據庫進行數(shù)據處理，結果明確顯示了兩個樣品中相同組分圖，差異組分圖以及每個樣品的特有組分列表。兩個廠家樣品二元比較的結果顯示廠家一的口服液中連翹酯苷A、連翹酯苷B、右旋羥基連翹酯苷A、牛蒡苷、蘆丁等的含量遠高于廠家二的口服液，而廠家二口服液中黃芩苷含量則較高。

討論:
UNIFI天然產物整體解決方案包括ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜、Xevo G2-S QTof四級桿飛行時間質譜以及含中藥數(shù)據庫的UNIFI軟件平臺。該解決方案中包含了五個預設的二元比較工作流程模板及一個結果報告模版，使數(shù)據的采集與處理、數(shù)據庫檢索、結構確認以及打印報告全部自動化。

圖2是不同廠家雙黃連口服液的UPLC/QTof MS 基峰離子色譜對比圖（BPI）。此圖顯示了采用超高效液相色譜分析復雜中藥體系的優(yōu)勢，運行時間短（有效分離時間為12 min），且分離效率與峰容量皆高。同時，四級桿飛行時間質譜又提供了含精確質量信息的質譜數(shù)據。除此之外，從圖2中可初步看出不僅這兩個生產廠家的化學成分復雜，而且口服液成分大多類似，如果不借助有效軟件的幫助從成分如此復雜的兩個樣品中快速準確找出其共性與差異幾乎是不可能的。

圖2 雙黃連口服液的UPLC/QTof MS 基峰BPI離子色譜二元比較圖（2a：廠家一的產品；2b：廠家二的產品）。

天然產物研究無論是單一樣品組分定性還是不同樣品的組分比較, 明確組分的詳細信息是進一步進行其他研究的基礎。對已知藥材樣品成分分析的工作流程已在之前應用紀要“應用UNIFI 天然產物整體解決方案分析綠茶提取物中的組分”（文獻編號：720004837zh）有詳細闡述。我們依此工作流程，從UNIFI中藥數(shù)據庫中導入與金銀花、黃芩、連翹中藥材有關的所有化學成分，然后進行數(shù)據處理，并對樣品中的組分信息進行鑒定。點擊任何一個預設的二元比較模板，便可得到與之相關的結果信息。比如，圖3便顯示了點擊二元比較概況總覽模板（Binary-Overview Plot）所得到的結果信息。

圖3 UNIFI軟件處理不同廠家雙黃連口服液的二元比較結果

圖3a顯示了UNIFI中預設的十四個工作流程模板。圖3b是兩個廠家樣品的UPLC/QTof組分二元比較圖。該圖中的綠色棒狀圖為與中藥數(shù)據庫所列成分所匹配且軟件自動鑒定的成分，黑色棒狀圖為沒有找到匹配因而無法自動鑒定的成分。圖3c是與圖3b相對應的單一選擇離子色譜圖 （XIC）比較（該圖顯示了保留時間4.03分鐘的連翹酯苷B的XIC的比較）。圖3d則是對應于3c所示成分的低能量通道質譜圖比較。

若想進一步了解兩個樣品間的異同，可分別通過點擊預設的Binary-Common工作模板或Binary-Difference工作模板直接看到兩個樣品間的相同成分與不同成分。比如，圖4顯示了點擊Binary-Common工作模板所得的結果。圖4a列出了兩個樣品中的相同組分（初步結果是1978個）。圖4b顯示了相應于圖4a的每個組分在兩個樣品中的質譜響應值，反應了該成分在每個樣品中的相對含量（該圖顯示的是漢黃芩素）。若點擊Binary-Difference工作模板，便可得到類似界面，結果顯示則是兩個樣品中的成分差異（初步結果是408個）。

圖4 點擊Binary-Common工作模板所得的結果

通過使用Binary-Common工作模板與Binary-Difference工作模板得到的兩個樣品間成分異同也可以用棒狀圖的方式更加直觀顯示。比如，在點擊Binary-Difference工作模板后得到兩個樣品中成分差異的結果，可通過點擊組分概要列表中的組分圖直接看到圖譜（圖5）。此圖使工作人員可以清晰直觀的觀察到兩個樣品間的差異。

這兩個口服液的差異結果顯示，廠家一的樣品黃芩苷含量明顯高于廠家二，而連翹中很多組分例如連翹酯苷A、連翹酯苷B、右旋羥基連翹酯苷A等成分在廠家二的含量遠高于廠家一。從圖5中還直接可以看到樣品中有些組分并沒有與中藥數(shù)據庫中所列成分相匹配，因而沒有得到相關的鑒定結果。此時如有需要，可進一步進行手動鑒定。

圖5 兩個口服液產品經二元比較以后所得成分差異圖

兩個樣品的成分差異的詳細信息可進一步通過應用Binary-Reference Unique及Binary-unknown Unique這兩個工作模板了解，從而可以得到每個樣品中的特有組分列表。 UNIFI 二元比較需要將其中一個樣品列為參照樣品（色譜或質譜峰在上），而將另一個樣品列為未知樣品（色譜或質譜峰在下）。在我們的樣品中，我們隨意將廠家二的樣品定為參照樣品，廠家一的樣品定為未知樣品。若想進一步觀察廠家一樣品中特有的成分直接點擊Binary- Unknown Unique模板即可，見圖6。結果提示廠家一特有組分193個。

圖6 點擊Binary- Unknown Unique模板所獲得的廠家一的樣品中特有的成分

在對結果確證滿意之后，可直接利用預設的二元比較報告模板打印報告。該報告包括了樣品的信息，樣品的采集和后處理方法，以及相同組分和不同組分信息的詳細列表。圖7為該報告中的一部分，顯示了兩個廠家的二元比較圖譜，同時色譜峰都自動標有化合物的名稱，結果一目了然。

圖7 通過導入天然產物組分信息總攬二元比較報告模自動得到的報告

結論：
本應用紀要系統(tǒng)的介紹了如何使用UNIFI天然產物整體解決方案中二元比較工作流程比較兩個不同廠家雙黃連口服液的成分異同。該工作流程以UPLC/QTof MS數(shù)據采集為基礎，輔以中藥數(shù)據庫并結合UNIFI中的結構自動鑒定功能，是嶄新的解決方案。此方案適用于解決一系列問題，比如對比不同產地的藥材或同一藥材的不同采摘時間及炮制過程，同一產品不同廠家的比較、同一廠家不同批次間產品的質量穩(wěn)定性等等。該解決方案中含有預設的五個二元比較工作流程模板及一個與其相關的報告模板，使研究人員可以迅速的對比不同的樣品，看其成分的異同， 為后期研究提供明確的思路。最終大大提高了中藥科研與質量監(jiān)控的有效性及工作效率。

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