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細(xì)胞技術(shù)專題：大鼠視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

瀏覽次數(shù)：1324　發(fā)布日期：2014-3-3　來源：上海北諾生物科技有限公司

牛血清培養(yǎng)法





	一、實(shí)驗(yàn)步驟 3. 加入含30g·L^-1小牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，37°C，50mL/L CO₂，100%濕度連續(xù)培養(yǎng)3 d 。 4. 3 d 后棄廢液，改為含 5g·L^-1小牛血清DMEM/F12 條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。二、形態(tài)學(xué)觀察每天在倒置顯微鏡，觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程和形態(tài)學(xué)變化并拍照。三、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 1. 將含細(xì)胞蓋玻片取出，0.01 mol·L^-1 PBS沖洗3 次×5 min。 2. 冷丙酮固定10 min。 3. PBS沖洗(3 次×5 min)。 4. 30g·L^-1過氧化氫室溫孵育15 min。 5. PBS沖洗3 次×5 min。 6. 滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min。 7. 滴加1:100 GC抗體，陰性對照以PBS代替一抗，37°C孵育60 min。 8. PBS沖洗3 次×5 min。 9. 滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，37°C，20 min。 10. PBS沖洗3 次×5 min。 11. 滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液。 12. DAB工作液顯色，自來水終止反應(yīng)。 13. 脫水，透明，DPX封片保存。四、結(jié)果培養(yǎng)的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色 GC 蛋白陽性，未加一抗的呈陰性。染色結(jié)果顯示成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞突起豐富，互相形成蜘蛛網(wǎng)狀(圖 3)。蘇木素復(fù)染，異質(zhì)細(xì)胞較少，90%以上為陽性細(xì)胞(圖 4)。圖 1. 培養(yǎng)第 3 天，細(xì)胞自視神經(jīng)遷出 (10×10) 圖 2. 培養(yǎng)第 15 天，純化的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞(10×40) Figure 3Positive expression of GC in oligodendrocytes at the seventh day (10×20) 圖 3. 培養(yǎng)第 7 天，少突膠質(zhì)細(xì)胞 GC 陽性表達(dá) (10×20) 收起
	一、討論抑制神經(jīng)再生基因Nogo的發(fā)現(xiàn)為視神經(jīng)損傷的修復(fù)、視功能保護(hù)研究帶來了希望。視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞2 種類型，分化不同，功能各異。成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞不再具有分裂增殖能力，為分裂終期細(xì)胞^[1]，培養(yǎng)較為困難。 1980 年McCarthy^[2]等建立了從腦灰質(zhì)組織分離、純化星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)模型。目前國內(nèi)外多采用該法^[3]。利用少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁能力的不同采用振動分離法進(jìn)行分離、培養(yǎng)。此法主要用來獲取星形膠質(zhì)細(xì)胞，獲得的少突膠質(zhì)細(xì)胞較少。存在著操作步驟多容易被污染、分離過程中因振蕩離心易造成機(jī)械性損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡等缺點(diǎn)。少突膠質(zhì)細(xì)胞和Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞是從一種普通雙潛能的少突膠質(zhì)細(xì)胞－2 型星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞發(fā)育而來^[1]。而血清等可以誘導(dǎo)O2A祖細(xì)胞分化為Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞^[1、4]。 GC是表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞膜以及髓鞘的一種主要類脂，它是識別少突膠質(zhì)細(xì)胞普遍應(yīng)用的特異性化學(xué)標(biāo)志物^[1、3]。二、文獻(xiàn)

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