1.  操作時(shí)動(dòng)作要輕，以免使蓋片上的細(xì)胞脫落。

 

一、細(xì)胞周期介紹

細(xì)胞周期（cell cycle)是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段 。

 

1.  間期

 

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。

 

（1）G1期　　

此期長(zhǎng)短因細(xì)胞而異。體內(nèi)大部分細(xì)胞在完成上一次分裂后，分化并執(zhí)行各自功能，此G1期的早期階段特稱(chēng)G0期。在G1期的晚期階段，細(xì)胞開(kāi)始為下一次分裂合成DNA所需的前體物質(zhì)、能量和酶類(lèi)等。

 

（2）S期　　

S期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)刻，DNA經(jīng)過(guò)復(fù)制而含量增加一倍，使體細(xì)胞成為4倍體，每條染色質(zhì)絲都轉(zhuǎn)變?yōu)橛芍�絲點(diǎn)相連接的兩條染色質(zhì)絲。與此同時(shí)，還合成組蛋白，進(jìn)行中心粒復(fù)制。S期一般需幾個(gè)小時(shí)。

 

（3）G2期　　

為分裂期做最后準(zhǔn)備。中心粒已復(fù)制完畢，形成兩個(gè)中心體，還合成RNA和微管蛋白等。G2期比較恒定，需用1～1.5小時(shí)。

 

2.  分裂期

 

細(xì)胞的有絲分裂（mitosis）需經(jīng)前、中、后，末期，是一個(gè)連續(xù)變化過(guò)程，由一個(gè)母細(xì)胞分裂成為兩個(gè)子細(xì)胞。一般需1～2小時(shí)。

 

（1）.前期（prophase）染色質(zhì)絲高度螺旋化，逐漸形成染色體（chromosome）。染色體短而粗，強(qiáng)嗜堿性。兩個(gè)中心體向相反方向移動(dòng)，在細(xì)胞中形成兩極；而后以中心粒隨體為起始點(diǎn)開(kāi)始合成微管，形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質(zhì)的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開(kāi)始瓦解為離散的囊泡狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

 

（2）中期（metaphase）細(xì)胞變?yōu)榍蛐危�核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細(xì)胞的赤道平面，從紡錘體兩極發(fā)出的微管附著于每一個(gè)染色體的著絲點(diǎn)上。從中期細(xì)胞可分離得到完整的染色體群，共46個(gè),其中44個(gè)為常染色體,2個(gè)為性染色體。男性的染色體組型為46，XY，女性為46,XX。分離的染色體呈短粗棒狀或發(fā)夾狀，均由兩個(gè)染色單體借狹窄的著絲點(diǎn)連接構(gòu)成。

 

（3）后期（anaphase）由于紡錘體微管的活動(dòng)，著絲點(diǎn)縱裂，每一染色體的兩個(gè)染色單體分開(kāi)，并向相反方向移動(dòng)，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時(shí)，細(xì)胞波拉長(zhǎng)，并由于赤道部細(xì)胞膜下方環(huán)行微絲束的活動(dòng)，該部縮窄，細(xì)胞遂呈啞鈴形。

 

（4）末期（telophase）染色單體逐漸解螺旋，重新出現(xiàn)染色質(zhì)絲與核仁；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡組合為核被膜；組胞赤道部縮窄加深，最后完全分裂為兩個(gè)2倍體的子細(xì)胞。

 

在體內(nèi)根據(jù)細(xì)胞的分裂能力可把它們分為三類(lèi)：

①增殖細(xì)胞群，如造血干細(xì)胞，表皮與胃腸粘膜上皮的干細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞始終保持活躍的分裂能力，連續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)。

②不再增殖細(xì)胞群，如成熟的紅細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等高度分化的細(xì)胞，它們喪失了分裂能力，又稱(chēng)終末細(xì)胞（end cell）。

③暫不增殖細(xì)胞群，如肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞。它們是分化的，并執(zhí)行特定功能的細(xì)胞，在通常情況下處于G0期，故又稱(chēng)G0期細(xì)胞。在某種刺激下，這些細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。如肝部分切除術(shù)后，剩余的肝細(xì)胞迅速分裂。

 

一、常見(jiàn)問(wèn)題

1.  Q：要做胃粘膜組織的DNA含量及倍體檢查，但取材后要等幾個(gè)星期才會(huì)做流式細(xì)胞術(shù)檢查，請(qǐng)問(wèn)：胃組織要怎樣保存好呢？用低溫保存，還是用乙醇固定？或者固定后再低溫下保存？

 

A：我做過(guò)乳腺細(xì)胞的DNA含量測(cè)定，取得組織以后，先處理成單細(xì)胞懸液，然后再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的最終濃度為50%，這樣固定的細(xì)胞懸液可以至少保存12小時(shí)，最多可保存一個(gè)月，上機(jī)檢測(cè)前再加PI綜合染液。我就是這樣做的，保存了將近三個(gè)星期，結(jié)果還可以，變異系數(shù)為5%.

 

2.  實(shí)驗(yàn)中想用PI分析細(xì)胞周期及凋亡率，請(qǐng)教幾個(gè)問(wèn)題：

 

Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配嗎？

 

A：RNaseA用PBS配制沒(méi)有問(wèn)題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

 

Q：（2）測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率時(shí)都要用RNAs酶，可以一起檢測(cè)嗎？

 

A：用流式細(xì)胞儀測(cè)定時(shí)細(xì)胞周期和凋亡率是同時(shí)測(cè)定的，不用擔(dān)心。

 

Q：（3）Triton－x－100是固定劑吧，用了70％的冷乙醇（是4℃嗎？），是不是就不用Triton－x－100固定了？

 

A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75％的乙醇于-20度固定。

 

Q：（4）還要設(shè)什么內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)（5％雞紅細(xì)胞）嗎？

 

A：對(duì)照肯定是需要的，這個(gè)根據(jù)自己的需要進(jìn)行設(shè)置。

 

Q：（5）不用試劑盒行不行啊？

 

A：完全可以不用試劑盒。

 

以下提供一個(gè)自己的實(shí)驗(yàn)步驟供參考：

 

（1）200×g離心10min收集細(xì)胞；

 

（2）棄去上清，PBS漂洗一次，將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上；

 

（3）進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)前，200×g離心10min收集固定后的細(xì)胞；

 

（4）PBS洗滌一次，200×g離心10min收集細(xì)胞；

 

（5）將細(xì)胞重懸于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室溫孵育30min；

 

（6）將經(jīng)PI染色和RNase A消化后的細(xì)胞懸液用300目的尼龍膜過(guò)濾后即可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分布和凋亡細(xì)胞定量的分析。

 

3.  Q：流式檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)加RNA酶所需的溫度？

 

A：其實(shí)有關(guān)RNA酶在凋亡檢測(cè)制樣過(guò)程中使用的必要性問(wèn)題尚有人持不同意見(jiàn)，該觀點(diǎn)的人認(rèn)為RNA酶在環(huán)境中無(wú)所不在，常規(guī)制樣過(guò)程中所接觸的試劑和環(huán)境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA，所以為了簡(jiǎn)便實(shí)驗(yàn)操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過(guò)經(jīng)典的方法還是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”。

 

至于染色時(shí)使用4度，是因?yàn)榈蜏乜蓽p弱分子運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)熒光染料結(jié)合的穩(wěn)定性和減少可能的熒光損耗。上流式前細(xì)胞用75％乙醇固定行嗎？

 

4.  Q：我養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，測(cè)周期�？吹教�子說(shuō)70％乙醇必須用PBS和乙醇配，用水配細(xì)胞會(huì)碎裂，有帖子說(shuō)PBS和乙醇配會(huì)出現(xiàn)絮狀物。上流式前細(xì)胞用75％乙醇固定，就用買(mǎi)來(lái)的現(xiàn)成的瓶裝75％乙醇，行嗎？必須那么嚴(yán)格嗎？

 

A：先用冷PBS懸浮細(xì)胞，大約1-2ml，充分懸浮，使細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞。之后緩慢加入無(wú)水乙醇，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)聚的現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞。乙醇固定之后沒(méi)有細(xì)胞沉淀。

 

5.  Q：我要做流式分析細(xì)胞周期，我大概收集了10的6次方細(xì)胞，但細(xì)胞在乙醇固定之后，還看到有細(xì)胞沉淀的，但PBS洗滌兩次之后，就基本沒(méi)什么細(xì)胞沉淀了，上機(jī)發(fā)現(xiàn)就發(fā)現(xiàn)不了細(xì)胞了。這是怎么回事啊？怎么解決這個(gè)問(wèn)題�。�

 

A：很可能是洗細(xì)胞的過(guò)程中丟失了，解決辦法有：

 

（1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機(jī)

 

（2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時(shí)最好殘留1mm左右的水膜，不要吸完。

 

（3）離心的轉(zhuǎn)速或時(shí)間可稍微增加一點(diǎn)兒

 

（4）每次加抗體時(shí)，吸頭最好不要接觸液面；混勻時(shí)最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細(xì)胞。