慢病毒，（ Lentivirus ）載體是以 HIV-1 （人類免疫缺陷 I 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。慢病毒在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá) RNAi 的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的 siRNA 半衰期短，體外合成慢病毒(RNAi)對(duì)基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá) siRNA 的載體，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄慢病毒(RNAi) 的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對(duì)基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成 siRNA ，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的 慢病毒(RNAi) 表達(dá)載體中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子來指導(dǎo) RNA 合成的，這是因?yàn)?nbsp;RNA 聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的 RNA 不會(huì)帶 poly A 尾。當(dāng) RNA 聚合酶Ⅲ遇到連續(xù) 4 個(gè)或 5 個(gè) T 時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 3' 端形成 1~4 個(gè)U 。 U6 和 H1 RNA 啟動(dòng)子是兩種 RNA 聚合酶Ⅲ依賴的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 莖環(huán)結(jié)構(gòu)（ stem loop ）。在 siRNA 表達(dá)載體中，構(gòu)成慢病毒(RNAi)-siRNA 的正義與反義鏈，可由各自的啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)錄，然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成 siRNA ；也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，慢病毒載體包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子和 4 ～ 5 T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有 1~4 個(gè) U 3 ' 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成 siRNA 。構(gòu)建慢病毒載體前通常要通過合成 siRNA 的方法，尋找高效的慢病毒(RNAi)siRNA ，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入 siRNA 表達(dá)載體。

慢病毒載體（ Lentiviral vector ）較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá) shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá) shRNA ，實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動(dòng)物細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動(dòng)物提供了可能性。

慢病毒表達(dá)載體包含了慢病毒載體構(gòu)建/包裝、轉(zhuǎn)染、慢病毒穩(wěn)定整合到目的細(xì)胞所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝 RNA 到重組的慢病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的慢病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用慢病毒感染宿主細(xì)胞，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。 

二、這一系統(tǒng)的目的，主要是為了解決以下問題：

1. 對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，慢病毒，感染能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為 RNAi，cDNA 克隆以及報(bào)告基因的研究提供了一個(gè)有利的途徑。

2. 慢病毒，進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選；

3. 慢病毒，為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；

在細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過病毒介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼蟠筇岣呋�因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，以達(dá)到目的基因的高效瞬時(shí)表達(dá)。

三、慢病毒載體介紹

慢病毒，載體（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因（RNAi ）導(dǎo)入動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基因組是正鏈 RNA ，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為 DNA ，形成 DNA 整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后， DNA0000 整合到細(xì)胞基因組中。整合后的 DNA 轉(zhuǎn)錄 mRNA ，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生， RNAi。

慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或 RNAi 干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體，能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。以上特性使（慢病毒載體）與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻(xiàn)研究表明，（慢病毒）載體介導(dǎo)的目的基因長期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。

（慢病毒）載體不表達(dá)任何 HIV-1 蛋白，免疫原性低，在注射部位無細(xì)胞免疫反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)也較低，不影響慢病毒病毒載體的第 2 次注射。

四、慢病毒載體的構(gòu)建

1. 構(gòu)建原理

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，但其基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除 gag、pol 和 env 這 3 個(gè)和單純逆轉(zhuǎn)錄病毒相似的結(jié)構(gòu)基因外，還包括 4 個(gè)輔助基因，vif、vpr、nef、vpu 和 2 個(gè)調(diào)節(jié)基因 tat 和 rev 。 HIV 21 是（慢病毒）中最具特征性的病毒，第一個(gè)慢病毒載體系統(tǒng)即以此病毒為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建的。慢病毒載體的構(gòu)建原理就是將 HIV 21 基因組中的順式作用元件 ( 如包裝信號(hào)、長末端重復(fù)序列 ) 和編碼反式作用蛋白的序列進(jìn)行分離。載體系統(tǒng)包括包裝成分和載體成分：包裝成分由 HIV 21 基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能反式提供產(chǎn)生慢病毒顆粒所需的蛋白；慢病毒載體成分與包裝成分互補(bǔ)，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的 HIV 21順式作用序列。同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒 (RCV ) 的可能性，將包裝成分的 5 ′ LTR 換成巨細(xì)胞病毒 (CMV ) 立即早期啟動(dòng)子，3 ′ LTR 換成 SV 40 polyA 位點(diǎn)等。將包裝成分分別構(gòu)建在兩個(gè)質(zhì)粒上，即一個(gè)表達(dá) gag 和 pol、另一個(gè)表達(dá) env 。根據(jù)這個(gè)原理，Naldini 和 Kafri 等構(gòu)建了三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)。