多光子共聚焦掃描顯微鏡的原理以及應用
多光子共聚焦顯微鏡是光學顯微鏡的重大改進，主要表現(xiàn)為可以觀察活細胞、固定細胞和組織的深層結構，并且可以得到清晰銳利的多層Z平面結構，即光學切片，并以此可以構建標本的三維實體結構。共聚焦顯微鏡采用激光光源，經(jīng)過擴充后充滿整個物鏡后焦平面，然后經(jīng)過物鏡的透鏡系統(tǒng)，在標本的焦平面上會聚成非常小的點。根據(jù)物鏡數(shù)值孔徑不同，最亮照明點直徑大小約0.25 ~ 0.8μm，深度約0.5 ~ 1.5μm。共聚焦點大小決定于顯微鏡設計、激光波長、物鏡特性、掃描單元狀態(tài)設定和標本性質。場式顯微鏡的照明范圍和照明深度都很大，而共聚焦顯微鏡的照明則集中到焦平面上的一個精確的焦點上。共聚焦顯微鏡最基本的優(yōu)點是可以對厚熒光標本（可以達到50 μm或以上）進行精細的光學切片，切片的厚度約為0.5到1.5μm。系列光學切片圖像可以通過精確的顯微鏡Z軸步進馬達上下移動標本獲得。圖像信息的采集被控制在精確的平面內，而不會被位于標本上其他位置發(fā)出的信號干擾。在去除背景熒光影響和增加信噪比后，共聚焦圖像的對比度和分辨率比傳統(tǒng)場式照明熒光圖像有明顯的提高。在很多標本中，許多錯綜的結構成分相互交織構成復雜的系統(tǒng)，僅用幾張光學切片很難還原標本本身的結構特征，但是一旦能夠采集到足夠的光學切片，我們就能通過軟件對其進行三維重建。這種實驗方法已經(jīng)被廣泛應用與生物學研究中，用來闡明細胞或組織之間復雜的結構和功能關系。
與傳統(tǒng)光學顯微鏡相比，多光子共聚焦顯微鏡具有更高的分辨率，實現(xiàn)多重熒光的同時觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點。所以它問世以來在生物學的研究領域中得到了廣泛應用。在對生物樣品的觀察中，多光子顯微鏡有其優(yōu)越性：對活細胞和組織或細胞切片進行連續(xù)掃描，可獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜系統(tǒng)的三維圖像�？梢缘玫奖绕胀晒怙@微鏡更高對比度、高解析度圖象、同時具有高靈敏度、杰出樣品保護。多維圖象的獲得，如7 維圖象(XYZaλIt): xyt、xzt 和xt 掃描,時間序列掃描旋轉掃描、區(qū)域掃描、光譜掃描、同時方便進行圖像處理。細胞內離子熒光標記，單標記或多標記，檢測細胞內如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測定及動態(tài)變化。熒光標記探頭標記的活細胞或切片標本的活細胞生物物質，膜標記、免疫物質、免疫反應、受體或配體，核酸等觀察；可以在同一張樣品上進行同時多重物質標記，同時觀察。對細胞檢測無損傷、精確、準確、可靠和優(yōu)良重復性；數(shù)據(jù)圖像可及時輸出或長期儲存。
當前，激光共聚焦顯微鏡較廣泛應用的研究領域有：細胞生物學：如：細胞結構、細胞骨架、細胞膜結構、流動性、受體、細胞器結構和分布變化、細胞凋亡機制；各種細胞器、結構性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞特異性結構的含量、組分及分布進行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗體對紫外線引起的DNA損傷進行觀察和定量；分析正常細胞和癌細胞骨架與核改變之間的關系；細胞黏附行為等。生物化學：如酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、雜色體基因定位等，利用共聚焦技術可以取代傳統(tǒng)的核酸印跡染交等技術，進行基因的表達檢測，使基因的轉錄、翻譯等檢測變的更加簡單、準確。藥理學：如藥物對細胞的作用及其動力學；藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量。生理學、發(fā)育生物學：如膜受體、離子通道、離子含量、分布、動態(tài)；動物發(fā)育以及胚胎的形成，骨髓干細胞的分化行為；細胞膜電位的測量，熒光漂白恢復（FRAP）的測量等。遺傳學和組胚學：如細胞生長、分化、成熟變化、細胞的三維結構、染色體分析、基因表達、基因診斷。神經(jīng)生物學：如神經(jīng)細胞結構、神經(jīng)遞質的成分、運輸和傳遞。微生物學和寄生蟲學：如細菌、寄生蟲形態(tài)結構。病理學及病理學臨床應用：如活檢標本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷。免疫學、環(huán)境醫(yī)學和營養(yǎng)學：如免疫熒光標記（單標、雙標或三標）的定位，細胞膜受體或抗原的分布,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位；對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態(tài)觀察可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達。
與傳統(tǒng)光學顯微鏡相比，多光子共聚焦顯微鏡具有更高的分辨率，實現(xiàn)多重熒光的同時觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點。所以它問世以來在生物學的研究領域中得到了廣泛應用。在對生物樣品的觀察中，多光子顯微鏡有其優(yōu)越性：對活細胞和組織或細胞切片進行連續(xù)掃描，可獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜系統(tǒng)的三維圖像�？梢缘玫奖绕胀晒怙@微鏡更高對比度、高解析度圖象、同時具有高靈敏度、杰出樣品保護。多維圖象的獲得，如7 維圖象(XYZaλIt): xyt、xzt 和xt 掃描,時間序列掃描旋轉掃描、區(qū)域掃描、光譜掃描、同時方便進行圖像處理。細胞內離子熒光標記，單標記或多標記，檢測細胞內如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測定及動態(tài)變化。熒光標記探頭標記的活細胞或切片標本的活細胞生物物質，膜標記、免疫物質、免疫反應、受體或配體，核酸等觀察；可以在同一張樣品上進行同時多重物質標記，同時觀察。對細胞檢測無損傷、精確、準確、可靠和優(yōu)良重復性；數(shù)據(jù)圖像可及時輸出或長期儲存。
當前，激光共聚焦顯微鏡較廣泛應用的研究領域有：細胞生物學：如：細胞結構、細胞骨架、細胞膜結構、流動性、受體、細胞器結構和分布變化、細胞凋亡機制；各種細胞器、結構性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞特異性結構的含量、組分及分布進行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗體對紫外線引起的DNA損傷進行觀察和定量；分析正常細胞和癌細胞骨架與核改變之間的關系；細胞黏附行為等。生物化學：如酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、雜色體基因定位等，利用共聚焦技術可以取代傳統(tǒng)的核酸印跡染交等技術，進行基因的表達檢測，使基因的轉錄、翻譯等檢測變的更加簡單、準確。藥理學：如藥物對細胞的作用及其動力學；藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量。生理學、發(fā)育生物學：如膜受體、離子通道、離子含量、分布、動態(tài)；動物發(fā)育以及胚胎的形成，骨髓干細胞的分化行為；細胞膜電位的測量，熒光漂白恢復（FRAP）的測量等。遺傳學和組胚學：如細胞生長、分化、成熟變化、細胞的三維結構、染色體分析、基因表達、基因診斷。神經(jīng)生物學：如神經(jīng)細胞結構、神經(jīng)遞質的成分、運輸和傳遞。微生物學和寄生蟲學：如細菌、寄生蟲形態(tài)結構。病理學及病理學臨床應用：如活檢標本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷。免疫學、環(huán)境醫(yī)學和營養(yǎng)學：如免疫熒光標記（單標、雙標或三標）的定位，細胞膜受體或抗原的分布,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位；對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態(tài)觀察可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達。
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